天津市津南區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所（300350）薄一君

連翹敗毒丸是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥方劑，主要由金銀花、連翹、梔子、黃芩等十余味藥組成，具有清熱解毒、消腫止痛的功效。金銀花中所含綠原酸具有抑菌抗炎，抗病毒，利膽保肝的作用[1]；連翹中所含連翹苷具有抗菌抗病毒的作用[2]。本文通過(guò)試驗(yàn)，建立了同時(shí)測(cè)定連翹敗毒丸中綠原酸與連翹苷含量的方法，該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于對(duì)連翹敗毒丸的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

島津LC-2010AHT高效液相色譜儀，LC solution工作站。迪馬C18色譜柱（250×4.6mm，5μm）；梅特勒-托利多AB265-S分析天平；島津UV2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；綠原酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110753-200413 ），連翹苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110821-201213 ）；連翹敗毒丸由天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂(lè)仁堂制藥廠提供（批號(hào)：B054100、C054118、C054120；規(guī)格：每袋裝9g）；甲醇、乙腈（色譜純）、磷酸（分析純）、水為純化水。

附表1 梯度洗脫系統(tǒng)

附表2 回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

附表3 三批樣品含量測(cè)定結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[3]流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按附表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為327nm（綠原酸），277nm（連翹苷），柱溫為40℃，流速為1.0ml/min，進(jìn)樣量10μl。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液：分別稱取綠原酸對(duì)照品和連翹苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含綠原酸和連翹苷各約50μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液：取裝量差異項(xiàng)下樣品，研細(xì)，混勻，取約1g，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液：取按處方比例及制法制成不含金銀花和連翹的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考查

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按上述色譜條件，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，以327nm和277nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，綠原酸與連翹苷與相鄰雜質(zhì)峰均能有效分離，且陰性樣品無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)附圖1、2、3。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取綠原酸與連翹苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml中分別含綠原酸16.614μg、27.69μg、55.38μg、83.07μg、110.76μg和含連翹苷14.475μg、24.125μg、48.25μg、72.375μg、96.50μg的溶液，按上述色譜條件分析，測(cè)定各自峰面積，以對(duì)照品濃度（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，求得綠原酸回歸方程：Y =11910.5X+501.9 r=0.9999（n=5）；求得連翹苷回歸方程Y =12572.6X+6510.6 r=0.9999（n=5）。結(jié)果表明綠原酸濃度在16.614～110.76μg范圍內(nèi)線性良好，連翹苷濃度在14.475～96.50μg范圍內(nèi)線性良好。

附圖1 A為綠原酸對(duì)照品；B為連翹苷對(duì)照品

附圖2 A為綠原酸樣品；B為連翹苷樣品

附圖3 A為綠原酸陰性；B為連翹苷陰性

2.3.3 進(jìn)樣重復(fù)性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按上述色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定對(duì)照品溶液中綠原酸和連翹苷峰面積，測(cè)得綠原酸峰面積的RSD為0.9%，測(cè)得連翹苷峰面積的RSD為1.2%。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（B054100）裝量差異項(xiàng)下的樣品，研細(xì)，按“2.2.2”供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定每份樣品中綠原酸和連翹苷含量。結(jié)果每g樣品中綠原酸平均含量為1.557mg，RSD為1.3%，連翹苷平均含量為1.206mg，RSD為1.5%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取已知含量的樣品制備供試品溶液，按上述色譜條件分別在0、2、4、6、8、10小時(shí)，測(cè)定樣品中綠原酸和連翹苷峰面積，測(cè)得峰面積值的RSD分別為0.46%和0.66%，說(shuō)明樣品溶液在10小時(shí)內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 取綠原酸和連翹苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為含綠原酸0.3692mg/ml、連翹苷0.3860mg/ml的對(duì)照品溶液；另取已知含量的樣品（B054100），研細(xì)，取約0.5g，共9份，精密稱定，分別精密加入上述對(duì)照品溶液各1.6ml、2.0ml、2.4ml各3份，再加甲醇分別至25ml，制得供回收率用供試品溶液，按上述色譜條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果綠原酸平均回收率為99.1%，RSD為0.9%；連翹苷平均回收率99.8%，RSD為0.6%。結(jié)果見(jiàn)附表2。

2.3.7 樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品，每批各平行制備2份供試品溶液，測(cè)定綠原酸和連翹苷含量。結(jié)果見(jiàn)附表3。

3 討論

參照《中國(guó)藥典》2010年版一部項(xiàng)下規(guī)定，結(jié)合光譜掃描，確定采用雙波長(zhǎng)測(cè)定兩種成分的含量。通過(guò)比較不同流動(dòng)相比例，篩選出上述最佳試驗(yàn)條件，主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰可以有效分離，同時(shí)，通過(guò)提高并保持有機(jī)相的比例，可以將雜質(zhì)峰洗脫出來(lái)。

同時(shí)本試驗(yàn)還對(duì)提取溶劑和提取方式進(jìn)行了考察，并最終確定了上述試驗(yàn)條件，該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于對(duì)連翹敗毒丸的質(zhì)量控制。