徐紹凱，陳洪波，范琳，劉喻

(桂林電子科技大學生命與環(huán)境科學學院，廣西 桂林 541004)

1 引 言

近年來人工智能技術(shù)的爆發(fā)，大大加快了機器學習、數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)在醫(yī)學領(lǐng)域中的應(yīng)用[1-2]。主要方法是通過對基因表達譜數(shù)據(jù)的挖掘以實現(xiàn)特征基因的提取、疾病相關(guān)基因的發(fā)掘、疾病分類、疾病發(fā)現(xiàn)等[3-5]。目前，對煙酒成癮者的基因研究大多是基因位點分析和基因文獻薈萃分析，它們能夠得到一些特定的基因或基因位點與煙酒成癮的關(guān)系，卻無法從基因間的共同作用和功能上發(fā)掘基因與煙酒成癮的相關(guān)性[6-7]。一些常用的差異表達基因提取方法目前也尚未被運用于煙酒成癮相關(guān)基因的提取[8-10]。本研究采用NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫所提供的煙酒成癮者的基因表達微陣列數(shù)據(jù)，通過基于R語言的方差分析，試圖找到與吸煙和飲酒高度相關(guān)的基因以及探索吸煙成癮與飲酒成癮的內(nèi)在聯(lián)系。對于煙酒成癮的治療和探尋與煙酒成癮相關(guān)的疾病有著十分重要的意義。

2 材料與方法

2.1 數(shù)據(jù)來源

本研究數(shù)據(jù)取自于美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫，收錄號為GSE20568，為吸煙與飲酒成癮者的腦組織基因表達微陣列數(shù)據(jù)[11]。GEO數(shù)據(jù)庫是NCBI基因表達匯編計劃所建立的數(shù)據(jù)庫，是目前世界上最大的基因表達數(shù)據(jù)倉庫和在線資源，其所收錄的數(shù)據(jù)擁有統(tǒng)一標準的格式以及關(guān)于數(shù)據(jù)的詳盡的介紹，在使用起來十分方便。數(shù)據(jù)共包括20個樣本，分別為吸煙且飲酒組、吸煙不飲酒組、不吸煙不飲酒組以及不吸煙飲酒組四組樣本，數(shù)據(jù)集中包含的基因探針數(shù)為8829個。對于每個樣本，原實驗中均可獲得完整的疾病史。所有飲酒者均有慢性過度飲酒的歷史，所有吸煙者根據(jù)其嚴重吸煙記錄，均被歸類為“煙草濫用者”[12]。所有樣本均沒有任何其他混雜的潛在的精神疾病的報告。數(shù)據(jù)中的20個樣本為原實驗中經(jīng)過篩選后的病例，病例之間在年齡，死亡間隔和PH方面沒有任何顯著差異。數(shù)據(jù)在原實驗中已進行標準化處理。

2.2 雙因素方差分析對差異表達基因的篩選

采用雙因素方差分析法對基因表達數(shù)據(jù)進行分析，篩選對吸煙和飲酒敏感的基因。在建立方差分析模型時，每一個表達數(shù)據(jù)稱為一個觀測值，基因的表達量稱為觀測變量，吸煙與飲酒是兩個控制變量，對基因表達微陣列數(shù)據(jù)中每一行基因進行雙因素方差分析。將樣本是否吸煙成癮作為一個控制變量，將樣本是否飲酒成癮作為另一個控制變量，利用方差分析分別求得每一條基因?qū)τ谑欠裎鼰煶砂a呈差異表達的P值以及對于是否飲酒成癮呈差異表達的P值。P<0.01被認為存在顯著差異。

2.3 使用DAVID軟件對差異表達基因做GO功能注釋與KEGG信號通路映射

原始數(shù)據(jù)中每一條基因的信息由EST數(shù)據(jù)庫的genebank收錄號給出，使用NCBI自帶的BLAST工具將經(jīng)過方差分析篩選出來的基因批量的與nucleotide數(shù)據(jù)庫中的基因序列進行對應(yīng)，將所得結(jié)果保存為XML文件，通過解析XML文件取得與每條基因相似度最高的nucleotide已知序列，得到該序列的genebank收錄號。將所得基因的genebank收錄號傳入DAVID分析網(wǎng)站中，得到GO功能注釋的生物過程(BP)和KEGG信號通路。DAVID分析操作步驟如下：提交基因集，選擇基因標識名為“GENEBANK_ACCESSION”，選擇基因集類型為“Gene List”；得到注釋結(jié)果摘要，包括多種注釋數(shù)據(jù)；選擇“GOTERM_BP_DIRECT”和“KEGG_PATHWAY”，并得到分析結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 吸煙(飲酒)成癮樣本的差異表達基因

在方差分析中，共得到197 (77)個與吸煙(飲酒)成癮相關(guān)的基因。使用層級聚類方法對吸煙(飲酒)成癮相關(guān)基因進行聚類分析， 20個樣本被聚成兩大類，第Ⅰ類樣本均為不吸煙(飲酒)的樣本，第Ⅱ類樣本均為吸煙(飲酒)成癮的樣本，篩選出的基因在兩類樣本中呈現(xiàn)明顯的差異性。197 (77)條基因共被聚成兩大類，第Ⅰ類基因在不吸煙(飲酒)樣本中普遍呈現(xiàn)高表達，在吸煙(飲酒)樣本中普遍呈現(xiàn)低表達，第Ⅱ類基因在吸煙(飲酒)樣本中普遍呈現(xiàn)高表達，在不吸煙(飲酒)樣本中普遍呈現(xiàn)低表達。

利用DAVID軟件對吸煙(飲酒)成癮相關(guān)基因進行分析。吸煙成癮相關(guān)基因GO功能注釋的生物過程(BP)見表1(P<0.05)。根據(jù)表1可以看出與吸煙相關(guān)的功能注釋大多與物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞遷移、信號傳導(dǎo)有關(guān)。飲酒成癮相關(guān)基因GO功能注釋的生物過程(BP)見表2(P<0.05)。從表2中可以看出飲酒相關(guān)的功能注釋同樣包括信號傳導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運。吸煙與飲酒相關(guān)的功能注釋中均包括細胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)功能。

3.2 煙酒成癮中均呈差異表達的基因

對比吸煙成癮相關(guān)基因與飲酒成癮相關(guān)基因，有七個基因在二者中均有出現(xiàn)，分別為TMEM53、IGFBP7、FN1、HNRNPA2B1、FLJ59422、SYNJ1、TLN2。

將七個基因?qū)τ诟髯缘乃念悩颖镜谋磉_量變化趨勢進行構(gòu)圖，見圖1，根據(jù)圖中每條線段斜率的正負可以得到飲酒與基因表達量之間的定性關(guān)系；比較圖中虛線段與實線段的相對位置可以得到吸煙與基因表達量之間的定性關(guān)系。

表1 吸煙成癮相關(guān)基因的GO功能注釋(BP)

從圖1中可以看出，TMEM53基因和TLN2基因的表達量對吸煙與飲酒均成明顯的負相關(guān)趨勢， IGFBP7、FN1、HNRNPA2B1、FLJ59422、SYNJ1基因?qū)ξ鼰熍c飲酒均成明顯的正相關(guān)趨勢。總體來看，七個基因在吸煙樣本中呈現(xiàn)高表達的，其在飲酒樣本中也必然呈現(xiàn)高表達，反之亦然。

表2 飲酒成癮相關(guān)基因的GO功能注釋(BP)

圖1 7條交叉的基因?qū)ξ鼰?、飲酒的健康與成癮樣本表達趨勢對比圖(NS在0處的點代表非吸煙非飲酒樣本，NS在1處的點代表非吸飲酒煙樣本，S在0處的點代表吸煙非飲酒樣本，S在1處的點代表吸煙飲酒樣本)

Fig1Comparisonoftheexpressionof7crossedgenesonsmokinganddrinkingbetweenhealthandaddiction(Thepointattheintersectionof0andNSrepresentsnon-alcohol-non-smokingsamples,thepointattheintersectionof1andNSrepresentsalcohol-non-smokingsamples,thepointattheintersectionof0andSrepresentsnon-alcohol-smokingsamples,thepointattheintersectionof1andSrepresentsalcohol-smokingsamples)

4 討論

吸煙與飲酒成癮和基因之間的關(guān)系已經(jīng)越來越明顯，但目前尚不能確定與煙酒成癮相關(guān)的基因以及其發(fā)病機理。利用生物信息學方法對煙酒成癮相關(guān)基因進行篩選是目前十分有效的方法之一。本研究選用雙因素方差分析分別提取對吸煙成癮和飲酒成癮呈現(xiàn)差異表達的基因，其中共有的差異表達基因有七條。

TMEM53基因編碼跨膜蛋白53(transmembrane protein 53)，該基因同其他跨膜蛋白一樣在轉(zhuǎn)運物質(zhì)及信號傳導(dǎo)方面具有一定的作用，與該基因有關(guān)的表型有增加痘苗病毒(VACV)感染、增加γ-H2AX磷酸化、降低CFP-tsO45G細胞表面轉(zhuǎn)運、增加轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)內(nèi)吞作用、減少IL-8分泌等[13-14]。

TLN2基因位于人類15號染色體，編碼與Talin 1相關(guān)的蛋白質(zhì)，是一種細胞骨架蛋白，在肌動蛋白絲的裝配和各種細胞類型的遷移中有著重要的作用[15]。IGFBP7基因編碼胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(insulin like growth factor binding protein 7)，與其相關(guān)的信號通路是細胞衰老和自噬，與該基因相關(guān)的GO功能注釋包括胰島素樣生長因子結(jié)合。FN1基因編碼纖維連接蛋白1(fibronectin 1)該蛋白參與了基質(zhì)重塑及細胞黏附和遷移過程[16]。HNRNPA2B1基因編碼的蛋白質(zhì)為不均一型核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1,HNRNPA2B1)。HNRNPA2B1蛋白參與很多重要的生理過程，包括RNA的轉(zhuǎn)錄、外顯子剪接、PremRNA的成熟降解、細胞分化及細胞凋亡等[17]。已有許多研究表明TLN2、IGFBP7、FN1和HNRNPA2B1基因與多種人類癌癥的發(fā)病、治療和預(yù)后有很強的關(guān)系，包括肝癌、乳腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、胃癌、食管鱗癌、口腔癌等惡性腫瘤[18-22]。本研究顯示這些基因與煙酒成癮具有很強的相關(guān)性，據(jù)此可初步推斷吸煙或飲酒會直接或間接影響此類惡性腫瘤的發(fā)病和治療，煙酒成癮與癌癥發(fā)病在基因?qū)用嫔系南嚓P(guān)性與發(fā)病機理有待進一步驗證。

FLJ59422基因編碼的蛋白質(zhì)高度相似于含GRAM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)3，,其余信息暫無相關(guān)研究和文獻資料[23]。

SYNJ1編碼一種磷酸肌醇磷酸酶蛋白(synaptojanin 1)，其在突出小泡的內(nèi)吞后循環(huán)中有重要作用，這種酶的表達可能影響突觸傳播和膜運輸[24]。已知的與SYNJ1基因相關(guān)的疾病包括早發(fā)性帕金森病和非典型青少年帕金森綜合征[25]。本研究顯示SYNJ1基因的表達同吸煙與飲酒具有相關(guān)性，其在吸煙與飲酒者中的表達量均為明顯的高表達。已有研究顯示吸煙者患帕金森病的風險比不吸煙者低63%，而既往吸煙者(已戒煙者)比不吸煙者低41%[26]。本研究通過對基因表達譜的分析，再次證實SYNJ1基因表達趨勢的變化可能對吸煙與飲酒者患帕金森病的幾率產(chǎn)生影響。

本研究發(fā)現(xiàn)的煙酒成癮相關(guān)基因均在物質(zhì)運輸、信號傳導(dǎo)、細胞外基質(zhì)和細胞周期中發(fā)揮一定的作用，長期吸煙與飲酒會引起這些基因表達量發(fā)生顯著變化，從而對神經(jīng)系統(tǒng)與細胞物質(zhì)運輸能力產(chǎn)生一定影響，當短時間戒斷時，機體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)與物質(zhì)運輸能力減弱，從而使人產(chǎn)生不適感，這很可能是煙酒成癮者產(chǎn)生戒斷反應(yīng)的原因之一。在整個腦區(qū)域，酒精具有許多潛在的目標，包括膜和幾個離子通道，而尼古丁通過特異性受體或結(jié)合蛋白起作用，長期使用酒精和尼古丁會使得大腦區(qū)域中產(chǎn)生適應(yīng)性變化，最終導(dǎo)致成癮[27]。已有大量研究證實多巴胺信號傳導(dǎo)和吸煙成癮有著重要的相關(guān)性，與之相關(guān)的基因包括DRD2、DAT1、NACHR等[28-29]。

5 總結(jié)

研究中使用雙因素方差分析對吸煙與飲酒者的基因表達數(shù)據(jù)進行差異表達基因提取，用層級聚類的方法對篩選出的特征基因繪制熱圖，觀察特征基因在四類樣本中的表達趨勢變化。取吸煙成癮者的特征基因與飲酒成癮者的特征基因的交集后，二者共有的基因包括TMEM53、IGFBP7、FN1、HNRNPA2B1、FLJ59422、SYNJ1、TLN2。根據(jù)DAVID分析結(jié)果以及對七個交叉基因的分析，認為煙酒成癮與信號傳導(dǎo)與物質(zhì)運輸之間存在重要的相關(guān)性，這對于臨床治療煙酒成癮具有一定的指導(dǎo)意義。通過對七個交叉基因的分析以及結(jié)合已有研究成果，查閱國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫資料得知，其中IGFBP7、FN1、HNRNPA2B1基因與癌癥的發(fā)病與治療存在密切的聯(lián)系，SYNJ1基因與帕金森綜合征存在密切聯(lián)系。綜合這些基因的生物學功能及已有研究結(jié)果，推知吸煙與飲酒極有可能與惡性腫瘤的發(fā)病和預(yù)后存在直接或間接的相關(guān)性，對于疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。