周寶宸，楊美娜，龐靖祥，張玉風(fēng)，韓金祥△

(1. 濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250020；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250062)

1 引 言

中藥藥性理論是中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的核心之一，狹義的中藥藥性是指寒、熱、溫、涼四性，而中醫(yī)在遣方用藥時(shí)運(yùn)用的中藥藥性，正是中藥寒、熱、溫、涼的四種偏性，即是“以偏糾偏”。在現(xiàn)代中藥藥性研究中的思路與方法雖然能在一定程度上區(qū)分中藥的四性，但是中醫(yī)側(cè)重于整體論，西醫(yī)則以還原論為主導(dǎo)，大多數(shù)利用現(xiàn)代科學(xué)探索中藥四性理論的研究都脫離了中醫(yī)基礎(chǔ)理論的整體觀念。

超微弱生物光子輻射(ultra-weak photon emission,UPE)，即機(jī)體的電磁輻射(量子)是生命運(yùn)動(dòng)的過程中最根本的物質(zhì)相互作用產(chǎn)生的現(xiàn)象，是生物分子一種微觀能級(jí)的改變，理解為生物分子高能態(tài)和低能態(tài)的相互躍遷[1]，是生物有機(jī)體的一個(gè)固有功能，是生命現(xiàn)象之本質(zhì)屬性[2]。生物光子起源于生命物質(zhì)中多模光子輻射與集體生物分子之間的一種相干非線性相互作用[3]。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生物光子輻射可以反映生物系統(tǒng)內(nèi)部的微觀信息及外界環(huán)境的微弱變化，且具有很高的靈敏度[4]和整體性。本研究利用柵藻作為生物指示劑的方法發(fā)現(xiàn)K值[5-6]可以表征中藥的寒熱藥性，在此基礎(chǔ)上，利用生物光子的相干性，通過對(duì)小鼠進(jìn)行中藥灌胃并進(jìn)行自發(fā)發(fā)光檢測，研究中藥藥性，探索最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，為基于小鼠中藥灌胃方法研究中藥藥性奠定基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)材料

KM小鼠：35～40 g成年KM小鼠，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，使用實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料，廠家：江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

主要儀器設(shè)備：9235QA型光電倍增管(英國ET Enterprises公司)，PM20SP型光電倍增管高壓電源(Sens-Tech公司)，C9744光子計(jì)數(shù)器(日本濱松公司HAMAMATSU)，PCI-e6320計(jì)數(shù)器卡(美國National Instruments公司)，超凈工作臺(tái)，尚朋堂電陶爐，康舒砂鍋，ACCULAB電子天平，燒杯，250 mL量筒，50 mL離心管，灌胃針，1 mL注射器。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 中藥煎煮液制備[7]

用電子天平秤取中藥20 g，取400 mL水，與秤取好的中藥共同置于砂鍋中，浸泡2 h后用電陶爐加熱，火力2000，煮沸后調(diào)整火力到800，煎煮15 min，六層紗布濾出藥液待用，再取400 mL水倒入鍋中重復(fù)上述煎煮步驟，合并兩次藥液，去滓、再煎至藥液剩余50 mL，終藥濃度為0.4 g/mL。

3.2 基于柵藻指示劑法中藥藥性K值測定

本研究選用熱性藥當(dāng)歸與寒性藥黃芩兩味藥進(jìn)行初步研究。在使用柵藻為生物指示劑[5-6]的中藥藥性研究方法中，對(duì)兩味藥進(jìn)行K值測定，重復(fù)3次，通過顧參數(shù)[8]擬合所得方程(見表1)及K值(見圖1)。

表1中，測得當(dāng)歸的三次重復(fù)測定K值分別為9.083、10.624、9.5479，黃芩三次重復(fù)測定K值分別為1.8653、1.8918、2.9718，且兩味藥三次重復(fù)測定的結(jié)果較穩(wěn)定。圖1中當(dāng)歸與黃芩兩味藥三次重復(fù)測量的藥性K值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，K值可將熱性藥當(dāng)歸與寒性藥黃芩明顯的區(qū)分出來。

表1基于柵藻生物指示劑法的當(dāng)歸與黃芩顧參數(shù)擬合方程

Table1TheAngelicaandScutellariaGu-parameterfittingequationbasedonbiologicalindicatorofscenedesmus

藥品 當(dāng)歸 黃芩K1 y=9.083x+725.39R2=0.9891 y=1.8653x+472.72R2=0.9292 K2 y=10.624x+659.9R2=0.9888 y=1.8918x+1200.9R2=0.9802K3 y=9.5479x+702.15R2=0.9841 y=2.9718x+1170.4R2=0.9836

圖1當(dāng)歸與黃芩三次重復(fù)測量K值

Fig1TheKvaluewasmeasuredrepeatedlyinthe

AngelicaandScutellaria

3.3 中藥灌胃小鼠16 d連續(xù)檢測

3.3.1實(shí)驗(yàn)條件 35～40 g成年小鼠，分籠喂養(yǎng)，每籠8只，適應(yīng)環(huán)境5 d后進(jìn)行灌胃及測量，剃腹部與背部被毛，中藥煎煮液藥物濃度0.4 g/mL，灌胃劑量0.1 mL/10 g(小鼠體重)，qd，每只小鼠測量前30 min灌胃。麻醉濃度及劑量為2%戊巴比妥鈉，0.025 mL/10 g(小鼠體重)，每只小鼠測量前5 min進(jìn)行麻醉。

參數(shù)設(shè)置：PM20SP型光電倍增管高壓電源設(shè)置數(shù)值：左726 V、右846 V；(1)Measurement time(s):1 s；Measurement points:300 ；(2)Measurement time(s):0.05 s；Measurement points:6000，腹部與背部測量時(shí)參數(shù)設(shè)置相同。

測量時(shí)要求室溫恒定為20℃，遮蓋黑色洞巾，暗室操作，減少光照及延遲發(fā)光對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。設(shè)置當(dāng)歸組、黃芩組、空白組三組，連續(xù)測量16 d，統(tǒng)計(jì)分析后比較三組測量值。

3.3.2數(shù)據(jù)處理分析 對(duì)測量間隔時(shí)間0.05 s，測量點(diǎn)6000的數(shù)值進(jìn)行處理,去除測量過程中由于儀器及環(huán)境因素所產(chǎn)生的異常值后，計(jì)算其平均值M，生物自發(fā)發(fā)光平均強(qiáng)度C=M×20-bg，即平均值乘20得出每秒的UPE平均強(qiáng)度，再減去20次檢測背景噪聲的平均值，即是本次測量的自發(fā)發(fā)光平均強(qiáng)度。將通過計(jì)算獲得的腹部UPE平均強(qiáng)度除以背部UPE平均強(qiáng)度，得到腹背自發(fā)發(fā)光平均強(qiáng)度比值，然后使用SPSS 19.0對(duì)各組之間腹背每秒U(xiǎn)PE強(qiáng)度進(jìn)行t-檢驗(yàn)。

4 結(jié)果與討論

4.1 腹部與背部自發(fā)發(fā)光平均強(qiáng)度

根據(jù)3.3.2中計(jì)算所得三組腹部與背部UPE強(qiáng)度(見圖2、圖3、圖4、圖5)的結(jié)果，我們對(duì)當(dāng)歸組與空白組、黃芩組與空白組的腹部UPE強(qiáng)度與背部UPE強(qiáng)度進(jìn)行比較，可以看出，當(dāng)歸組與空白組、黃芩組與空白組腹部與背部UPE強(qiáng)度隨檢測天數(shù)的增加均出現(xiàn)逐漸增高的趨勢，而這一趨勢與小鼠的體重的增加有關(guān)，但相同檢測天數(shù)的當(dāng)歸組與空白組、黃芩組與空白組UPE強(qiáng)度之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這正說明了生物發(fā)光所表述的是生命體的整體狀態(tài)[9-10]，它攜帶著大量的生物學(xué)信息，包括體重、體溫、饑飽度、勞累度、情志、及其他小鼠自身或者儀器穩(wěn)定性等因素影響，而這些微量因素的共同作用造成了小鼠整體狀態(tài)的改變，在生物光子測量中反映在UPE強(qiáng)度的變化，所以灌胃的強(qiáng)條件刺激這單一變量所造成的影響則被其他影響因素的疊加所湮滅。

圖2當(dāng)歸組與空白組腹部自發(fā)發(fā)光強(qiáng)度隨灌胃天數(shù)變化

Fig2TheSPIoftheabdomenofAngelicagroupandblankgroupwaschangedwiththenumberofdays

圖3當(dāng)歸組與空白組背部自發(fā)發(fā)光強(qiáng)度隨灌胃天數(shù)變化

Fig3TheSPIofthebackofAngelicagroupandblankgroupchangedwiththenumberofdays

圖4黃芩組與空白組腹部自發(fā)發(fā)光強(qiáng)度隨灌胃天數(shù)變化

Fig4TheSPIoftheabdomenofScutellariagroupandblankgroupwaschangedwiththenumberofdays

圖5黃芩組與空白組腹部自發(fā)發(fā)光強(qiáng)度隨灌胃天數(shù)變化

Fig5TheSPIofthebackofScutellariagroupandblankgroupchangedwiththenumberofdays

4.2 中藥灌胃小鼠腹背自發(fā)發(fā)光強(qiáng)度比值與最佳檢測時(shí)間

為了凸顯灌胃單一影響因素的作用及結(jié)果，我們利用小鼠腹部UPE強(qiáng)度與背部UPE強(qiáng)度的比值的數(shù)據(jù)處理方法來消除灌胃以外的其他因素的影響，包括小鼠自身及儀器穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖6、圖7。

圖6為當(dāng)歸組與空白組連續(xù)檢測16 d腹部與背部UPE強(qiáng)度比值變化，可知當(dāng)歸組與空白組腹背UPE強(qiáng)度比值相比，當(dāng)歸組腹背UPE強(qiáng)度比值有升高的趨勢，并且在第1 d到第4 d間斷產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在第5 d到第11 d當(dāng)歸組與空白組腹背UPE強(qiáng)度比值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異持續(xù)存在，在第12 d至第16 d內(nèi)，兩組比值之間未測及差異產(chǎn)生。這說明當(dāng)歸組小鼠在第5 d至第11 d內(nèi)通過當(dāng)歸中藥煎煮液灌胃的腹背UPE強(qiáng)度的比值與空白組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同樣說明第5 d至第11 d是使用當(dāng)歸中藥煎煮液灌胃小鼠產(chǎn)生效果最穩(wěn)定的時(shí)間和在3.3.1中的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行自發(fā)發(fā)光檢測最佳的時(shí)間。

圖7是黃芩組與空白組連續(xù)檢測16 d腹部與背部UPE強(qiáng)度的比值變化，從圖中我們可以看出黃芩組與空白組腹背UPE強(qiáng)度比值相比較，黃芩組腹背UPE強(qiáng)度比值有降低的趨勢，兩組UPE強(qiáng)度的比值之間在第2 d到第10 d內(nèi)所產(chǎn)生的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異持續(xù)存在，在第11 d至第16 d內(nèi)，兩組比值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異只在第12 d與第15 d時(shí)出現(xiàn)，其余時(shí)間均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說明黃芩組小鼠在第2 d至第10 d內(nèi)通過黃芩中藥煎煮液灌胃的腹背UPE強(qiáng)度的比值與空白組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這也表明這段時(shí)間是使用黃芩中藥煎煮液灌胃小鼠產(chǎn)生效果最穩(wěn)定的時(shí)間和在3.3.1中的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行自發(fā)發(fā)光檢測最佳的時(shí)間。

由于不同中藥所具有的藥性的差別，灌胃后中藥煎煮液作用于小鼠的效果強(qiáng)弱不同，在3.3.1的實(shí)驗(yàn)條件下我們所進(jìn)行的灌胃小鼠超微弱發(fā)光的檢測中，雖然在灌胃的第1 d均開始表現(xiàn)出變化，并且熱性藥(當(dāng)歸)的比值相較空白組的比值升高，寒性藥(黃芩)的比值相較空白組的比值降低，但其產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的灌胃時(shí)間不盡相同。綜上，無論熱性藥或者寒性藥，在上述實(shí)驗(yàn)條件下使用中藥煎煮液對(duì)小鼠灌胃的第5 d到第10 d之間，可以作為基于小鼠超微弱發(fā)光的中藥藥性研究實(shí)驗(yàn)檢測的最佳時(shí)間。

圖6當(dāng)歸組與空白組連續(xù)檢16d腹部與背部自發(fā)發(fā)光強(qiáng)度比值,A-P

Fig6TheratioofSPIoftheabdomenandbackfor16daysintheAngelicagroupandtheblankgroup,A-P

圖7黃芩組與空白組連續(xù)檢測16天腹部與背部自發(fā)發(fā)光強(qiáng)度比值,A-P

Fig7TheratioofSPIoftheabdomenandbackfor16daysintheScutellariagroupandtheblankgroup,A-P

5 結(jié)論

本研究主要探討基于小鼠超微弱發(fā)光的中藥藥性研究的實(shí)驗(yàn)中對(duì)于不同寒熱藥性中藥灌胃小鼠在其腹背自發(fā)發(fā)光比值中所表現(xiàn)出的趨勢及差異和產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的最佳檢測時(shí)間，并通過不同藥組與空白組腹背自發(fā)發(fā)光比值所產(chǎn)生的差異來表征不同的中藥藥性。首先通過基于柵藻生物指示劑法重復(fù)測定當(dāng)歸與黃芩的K值，驗(yàn)證了使用柵藻指示劑法的K值來表征中藥藥性這一種方法的穩(wěn)定性；然后通過對(duì)當(dāng)歸藥組灌胃小鼠與空白組小鼠、黃芩藥組灌胃小鼠與空白組小鼠腹部與背部UPE強(qiáng)度比值的分析，發(fā)現(xiàn)無論熱性、寒性藥組在灌胃的第一天即開始發(fā)生變化，當(dāng)歸組的腹背UPE強(qiáng)度比值相較空白組升高,黃芩組腹背UPE強(qiáng)度比值相較空白組降低；當(dāng)歸組與空白組、黃芩組與空白組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異并且這種統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均穩(wěn)定存在的時(shí)間為第5 d和第10 d之間，同時(shí)這也是基于小鼠超微弱發(fā)光的中藥藥性研究的實(shí)驗(yàn)中對(duì)小鼠使用中藥煎煮液灌胃后的生物發(fā)光行為最佳檢測時(shí)間。

韓金祥等[11-12]基于生物光子相干理論[13]提出中藥藥性量子假說，提出機(jī)體電磁輻射(量子)可以表征中醫(yī)之氣[14-15]，四氣是調(diào)節(jié)機(jī)體電磁輻射量子疊加態(tài)的度量，通過檢測不同藥性中藥生物光子輻射行為的差異，可從整體上獲得表征中藥藥性的生物光子量化指標(biāo)。在此理論的指導(dǎo)下，本研究在探索并優(yōu)化的基于小鼠超微弱發(fā)光的中藥藥性研究的實(shí)驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，連續(xù)檢測16 d當(dāng)歸與黃芩中藥煎煮液灌胃后小鼠的生物發(fā)光行為，發(fā)現(xiàn)其不同中藥灌胃組與空白組的腹背UPE強(qiáng)度比值均在第5 d至第10 d存在穩(wěn)定的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并認(rèn)為此段時(shí)間為中藥煎煮液灌胃后小鼠生物發(fā)光行為的最佳檢測時(shí)間。當(dāng)然，這只是基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的初步結(jié)論，還需要大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，但是這為基于小鼠超微弱發(fā)光的中藥藥性研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的搭建奠定了基礎(chǔ)，為利用生物發(fā)光的方法研究中藥藥性開辟了新道路，為中藥藥性的研究提供了新的思路。