福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院/福建省醫(yī)學(xué)測試重點實驗室/福建省新藥安全性評價中心，福建 福州 350001

黃酮類化合物是一類存在于自然界的具有多種生理活性的有機化合物[1]，研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、消炎、保護心血管等作用[2]。天然的黃酮類化合物多以苷元形式存在，由于糖的種類和位置等差異，其結(jié)構(gòu)也各有不同，不同黃酮類中藥對應(yīng)的最適提取方法也有差異[3]，本實驗以最常見5種黃酮類中藥為材料，研究其最適的總黃酮提取方法，為其他中藥的總黃酮提取提供參考。

1 儀器與材料

1.1 材料 蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所)，乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純，購自國藥試劑集團。藥材來源見表1。

1.2 儀器 Thermo Multiskan GO全波長酶標儀、國華HH-1恒溫水浴鍋、Beckman Allegra X-22臺式高速離心機、AS3120B超聲波清洗儀。

表1 五種常用的黃酮類中藥

2 方法

2.1 標準曲線繪制 精確量取濃度200 μg/mL蘆丁標準溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置于10 mL容量瓶中。向容量瓶中分別加60%乙醇5.0、4.8、4.6、4.2、3.8、3.4、3.0 mL。然后加5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，靜置6 min。再加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，靜置6 min。加4%氫氧化鈉4.0 mL，用60%的乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12 min。最后于510 nm波長下測定吸光度，并以蘆丁標準濃度值為縱坐標，以吸光度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2 樣品總黃酮提?。?/p>

2.2.1 加熱提取 稱取500 mg樣品于10 mL離心管中，每管加4 mL 不同質(zhì)量分數(shù)的乙醇溶液(50%、60%和70%)，放水浴鍋60 ℃浸提2 h，6000 r/min離心10 min，離心后取上清液于10 mL容量瓶中，再向離心管中加4 mL的不同質(zhì)量分數(shù)的乙醇溶液，放水浴鍋60 ℃浸提1 h，6000 r/min離心10 min，離心后取上清液于10 mL容量瓶中，定容。

2.2.2 超聲提取 稱取500 mg樣品于10 mL離心管中，每管加8 mL的60%乙醇溶液，放入超聲儀中提取，300 W提取時間分別為15 min、30 min和45 min，然后6000 r/min離心10 min，離心后取上清液于10 mL容量瓶中，定容。

2.3 含量測定 準確吸取總黃酮提取液2.0 mL于10 mL容量瓶中，按標準曲線方法的步驟測定吸光度，將吸光度代入標準曲線計算樣液的總黃酮含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標準曲線的制作 以吸光度為橫坐標，不同濃度蘆丁標準溶液為縱坐標，得回歸方程為y=358.61x-0.2161，R2= 0.9967表明吸光度與濃度在0～50 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。如圖1所示。

3.2 不同濃度乙醇溶液對5種中藥材總黃酮提取的影響 不同濃度乙醇提取中藥材總黃酮含量略有差異，銀杏葉和葛根在50%乙醇提取液中總黃酮含量較高，隨著濃度的提高，提取率反而下降；槐花在不同乙醇濃度中提取量差異不大，黃芩在60%乙醇提取液中總黃酮含量較高，70%乙醇提取液中總黃酮含量差異不大；而陳皮在60%乙醇提取液中總黃酮含量達到最高。因此，銀杏葉和葛根最適的乙醇提取濃度為50%，黃芩和陳皮最適乙醇提取濃度為60%。見表2。

表2 不同濃度乙醇溶液提取5種中藥材總黃酮含量

3.3 不同超聲時間對5種中藥材總黃酮提取的影響 不同超聲提取時間對5種常用中藥的總黃酮提取具有一定差異(表3)，黃芩、葛根、銀杏葉和陳皮隨著超聲時間的延長，總黃酮含量提取量基本保持不變。而槐花隨著超聲時間的延長，總黃酮含量有所下降，推測超聲提取對部分黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用，導(dǎo)致總黃酮含量下降。對比加熱提取法發(fā)現(xiàn)，槐花和葛根的總黃酮提取量有所下降，而銀杏葉和陳皮提取量有所提高，黃芩差異不大。因此，槐花和葛根總黃酮不適用超聲提取，銀杏葉、陳皮和黃芩可以選擇超聲提取。

表3 不同超聲時間提取5種中藥材總黃酮含量

4 討論

研究表明，中藥總黃酮提取受到提取時間、提取溫度、液固比和乙醇濃度等因素的影響[4]，不同中藥中黃酮類物質(zhì)具有結(jié)構(gòu)差異，提取工藝也有不同，杜志云等研究超聲提取槐花總黃酮時，使用200 W提取30 min時提取率最高，隨著時間的延長提取率反而有所下降，因此，使用超聲提取槐花總黃酮時，需要控制提取功率及時間，與本研究結(jié)果類似[5]。項昭保等研究超聲提取黃芩中，使用150 W提取50 min時提取率最高，隨著超聲時間延長提取量下降，與本研究結(jié)果類似[6]。朱德艷等研究超聲提取葛根總黃酮和林林等研究超聲提取陳皮總黃酮時，發(fā)現(xiàn)提取時間對總黃酮影響最小，與本研究結(jié)果一致[7-8]。綜上，不同中藥使用超聲提取時需要注意提取功率及時間，要研究清楚原因，需要進一步研究其所含黃酮的結(jié)構(gòu)。