張雪竹，付于，賈玉潔，韓景獻(xiàn)，聶坤

阿爾茲海默?。ˋD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機制一直是困擾醫(yī)學(xué)界的主要問題之一，其病理表現(xiàn)主要是神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)形成和神經(jīng)元外的老年斑，臨床表現(xiàn)多為伴隨衰老出現(xiàn)明顯的記憶障礙、失語、認(rèn)知能力下降等［1］。近年來有關(guān)AD的研究不斷深入，但其發(fā)病機制復(fù)雜，迄今為止無論是其生物學(xué)機制還是臨床療法如淀粉樣蛋白疫苗均未取得關(guān)鍵性的突破［2］。已知衰老是AD最主要的危險因素，然而衰老因素如何在分子和細(xì)胞水平引起神經(jīng)元功能障礙，相關(guān)機制并未得到充分闡明。

SAMP8小鼠作為典型的快速老化、癡呆小鼠，是常用的AD動物模型。相對于正常老化的SAMR1小鼠，SAMP8小鼠在進(jìn)入成年期時迅速出現(xiàn)顯著的老化特征，在形態(tài)上出現(xiàn)明顯衰老態(tài)，病理上表現(xiàn)以腦干為中心出現(xiàn)海綿狀變化，同時出現(xiàn)典型的認(rèn)知障礙，因而成為研究腦老化和癡呆關(guān)系的理想動物模型［3］。本研究以SAMP8小鼠為模型，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）定性蛋白質(zhì)組學(xué)方法，檢測小鼠老化過程中海馬組織脂筏募集的蛋白質(zhì)種類的變化，在細(xì)胞生物學(xué)層面揭示海馬組織在老化過程中的關(guān)鍵變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SAMP8小鼠和SAMR1小鼠，均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SAM鼠繁育中心提供［許可證號SXCK（津）2015-0003］。SAMP8和SAMR1小鼠飼養(yǎng)在完全相同條件下，自由取食飲水。本研究經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 Ficoll分離液和線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購于Sigma公司，蛋白酶抑制劑購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 抓鬮法隨機選取2月齡和8月齡SAMP8小鼠各40只，雌雄各半，分別定義為SAMP8幼年組、SAMP8老年組；另外抓鬮法隨機選取同月齡SAMR1小鼠各40只，設(shè)為正常老化對照，分別定義為SAMR1幼年組、SAMR1老年組。

1.2.2 提取小鼠海馬組織脂筏 脂筏提取采用蔗糖密度梯度超速離心法［4］：小鼠頸椎脫臼處死，剝?nèi)⊥暾ｑR組織，投入事先加入預(yù)冷脂筏提取液的玻璃勻漿器中充分勻漿，脂筏提取液的體積按質(zhì)量/體積比（m/V）400 g/L計算，并加入5 mL的蛋白酶抑制劑。勻漿液先在EP管中靜置90 min（4℃），再以1 000×g離心15 min。上清液置于40%蔗糖中超速離心，離心管由下至上蔗糖密度梯度依次為40%、30%和5%，蔗糖離心參數(shù)：Hitachi Himac CP80WX，轉(zhuǎn)頭P80AT，4℃，200 000×g離心20 h。超速離心完成后，5%蔗糖與30%蔗糖分界處的乳黃色脂質(zhì)物質(zhì)即為脂筏，用注射器取出后置于-80℃冰箱備用。

1.2.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法蛋白質(zhì)分析（HPLC-MS/MS 1D-LTQ） 脂筏樣品的酶解和肽鏈純化以及后續(xù)的質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)鑒定均由上海中科新生命生物科技有限公司提供技術(shù)服務(wù)。每組樣品按照預(yù)實驗方法各進(jìn)行3次重復(fù)實驗。大致步驟如下：HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)，采用shotgun analysis蛋白質(zhì)鑒定，選用Swissport數(shù)據(jù)庫，物種選小鼠，設(shè)定好篩選參數(shù)，利用Bioworks Bioworks 3.1 software（Thermo）軟件中的Turbo SEQUEST程序，將MS/MS蛋白表達(dá)譜自動在小鼠數(shù)據(jù)庫（IPI MOUSE v3.29）進(jìn)行檢索，合并輸出每組樣品蛋白鑒定列表。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 鑒定出的蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)注釋和KEGG分析均采用DAVID生物信息學(xué)在線分析工具完成（https://david.ncifcrf.gov/geneReport.jsp），具體操作見網(wǎng)站指南。脂筏蛋白組的細(xì)胞定位分析，采用DAVID網(wǎng)站的GO注釋工具；脂筏蛋白組的代謝網(wǎng)絡(luò)分析，勾選KEGG選項。

1.2.5 小鼠Morris水迷宮動物行為學(xué)分析 Morris水迷宮隱蔽平臺測試具體方法見文獻(xiàn)［5］。整個測試為期5 d，方法簡述如下：每次測試時，先將小鼠輕輕放入水中，面朝池壁，再打開行為學(xué)軟件，記錄小鼠的游泳路線，統(tǒng)計小鼠從入水到找到平臺的長度和時間（逃避潛伏期，escape latency）；待小鼠在平臺上休息20 s后再次測試。如果小鼠120 s內(nèi)沒找到平臺，潛伏期成績記為120 s。每天在2個入水點各測試1次，以2次潛伏期的算術(shù)均值作為這一天的成績，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.6 海馬組織線粒體提取 采用Clark方法［6］，在0～4℃環(huán)境下進(jìn)行。完整海馬組織用分離介質(zhì)洗去表面血跡后，置于預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入2 mL預(yù)冷的分離介質(zhì)液（0.025 mmol/L蔗糖，0.075 mol/L甘露醇，1 mmol/L EGTA），手動充分勻漿。勻漿液離心3 min（4℃，2 000×g），取上清液再次離心8 min（4℃，12 500×g）。棄上清，沉淀加入3%的Ficoll液5 mL（3%Ficoll，0.12 mol/L蔗糖，0.03 mol/L甘露醇，25 μmol/L EDTA-K，Tris調(diào)整pH=7.4）中懸浮，仔細(xì)分層入6%Ficoll液10 mL（6%Ficoll，0.12 mol/L蔗糖，0.03 mol/L甘露醇，25 μmol/L EDTA-K，Tris調(diào)整pH=7.4），10 400×g離心30 min，沉淀，用分離介質(zhì)懸浮，12 100×g離心10 min，所得沉淀即為線粒體。稀釋后馬上用于線粒體功能檢測。

1.2.7 線粒體膜電位檢測 使用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）和流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位。以BCA方法定量線粒體濃度，再把線粒體懸浮液調(diào)整到統(tǒng)一濃度，按照試劑盒說明，試管中加入JC-1熒光試劑及線粒體常溫孵育30 min，以流式細(xì)胞儀（BD）檢測紅色熒光和綠色熒光值，JC-1單體檢測設(shè)置激發(fā)光波長為490 nm，發(fā)射光為530 nm；JC-1聚合物檢測設(shè)置激發(fā)光波長為525 nm，發(fā)射光為590 nm。對捕獲的紅色和綠色熒光信號進(jìn)行分析，紅、綠熒光值的比值代表膜電位的高低。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，Morris水迷宮數(shù)據(jù)組間均數(shù)比較采用具有一個重復(fù)測量的雙因素方差分析（Two-way ANOVA），線粒體膜電位數(shù)據(jù)組間均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

Fig.1 Results of performance of the aged SAMP8 and the control SAMR1 mice during the five training days of a hidden platform圖1 SAMP8老年組和SAMR1老年組小鼠在5 d的隱藏平臺成績測試中的表現(xiàn)

2.1 Morris水迷宮動物行為學(xué)檢測 圖1顯示了在5 d訓(xùn)練期內(nèi)各老年組小鼠Morris水迷宮逃避潛伏期的學(xué)習(xí)成績曲線。在Morris水迷宮測試中，SAMP8老年組和SAMR1老年組小鼠在5 d的訓(xùn)練中逃避潛伏期均顯著縮短，小鼠品系之間的逃避潛伏期成績差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F品系=9.283，P＜0.01）。成年SAMR1小鼠的逃避潛伏期在5 d的訓(xùn)練中一直在減少，但SAMP8小鼠僅在最初3 d內(nèi)發(fā)現(xiàn)隱藏平臺在減少，最后2 d不再減少，這與SAMR1小鼠明顯不同，提示SAMP8老年組小鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。

2.2 海馬組織中脂筏蛋白質(zhì)組的鑒定和注釋 采用定性分析的shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定出各組脂筏樣本的蛋白質(zhì)種類。對蛋白質(zhì)組進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)最大的功能群體是線粒體蛋白質(zhì)，提示線粒體對神經(jīng)元的功能非常關(guān)鍵。結(jié)果顯示，SAMP8和SAMR1小鼠海馬組織脂筏募集的蛋白質(zhì)種類和數(shù)目均隨月齡增加而減少，提示老化因素引發(fā)海馬組織細(xì)胞生命活動的明顯衰退，見表1。

2.3 老年組SAMP8小鼠海馬組織脂筏蛋白質(zhì)組的GO富集分析 以幼年組小鼠的脂筏蛋白質(zhì)組為背景，對老年組小鼠的海馬組織脂筏蛋白質(zhì)組的富集分析，結(jié)果見表2。正常老化的SAMR1小鼠海馬組織脂筏蛋白質(zhì)組細(xì)胞定位富集度前10的詞條中，排在前4的均是線粒體相關(guān)詞條，其中，線粒體排在第2位，提示老化過程中線粒體功能在神經(jīng)元細(xì)胞功能中的關(guān)鍵作用。

Tab.2 Top 10 term s that aging factors affect the enrichment of lipid rafting proteome in hippocampus表2 老化因素影響海馬組織脂筏蛋白質(zhì)組細(xì)胞定位的富集度排名前10詞條

快速老化的SAMP8小鼠海馬組織脂筏蛋白質(zhì)組細(xì)胞定位富集度前10的詞條中，排在前3的均是線粒體相關(guān)詞條。與正常老化對照組SAMR1比較，SAMP8有兩個明顯不同：線粒體從第2降到第6位；線粒體相關(guān)詞條的蛋白數(shù)目均大幅度減少。結(jié)果提示，老化過程中，對比SAMR1小鼠，SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞功能中發(fā)生的關(guān)鍵性變化可能是線粒體功能的顯著衰退。

2.4 老年組SAMP8小鼠海馬組織脂筏蛋白質(zhì)組的KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)途徑分析 對小鼠海馬組織脂筏蛋白質(zhì)組進(jìn)行KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)途徑分析，結(jié)果顯示，對照組SAMR1小鼠有統(tǒng)計學(xué)意義的關(guān)鍵KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)途徑有4個，排在首位的是線粒體的氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）通路，其余3個均為神經(jīng)退行性病變相關(guān)代謝途徑。與SAMR1不同，快速老化SAMP8小鼠有統(tǒng)計學(xué)意義的6項代謝途徑中，排在前2位的是亨廷頓病和AD代謝途徑，線粒體的氧化磷酸化代謝途徑排在第3位，該途徑的蛋白數(shù)目大幅度減少。結(jié)果提示，老化過程中對比對照組SAMR1小鼠，SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元線粒體氧化磷酸化代謝功能顯著衰退。見表3。

Tab.3 Analysis of KEGG pathway in hippocam pal lipid rafts during aging表3 老化因素對SAMP8海馬組織脂筏蛋白質(zhì)影響的KEGG代謝通路分析

2.5 SAMP8小鼠海馬組織線粒體膜電位的檢測 如圖2示，SAMR1小鼠老化過程中線粒體膜電位顯著下降（92.77%±10.05%vs.84.52%±10.37%，t=3.350，P＜0.01），提示在老化過程中線粒體氧化磷酸化功能也顯著下降；SAMP8小鼠老化過程中線粒體膜電位也顯著下降（90.12%±12.93%vs.68.34%±11.42%，t=4.509，P=0.001）。與 SAMR1小鼠不同的是，SAMP8小鼠線粒體膜電位下降幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過SAMR1小鼠。線粒體膜電位的下降反映線粒體氧化磷酸化功能的衰退，結(jié)果提示，在老化過程中SAMP8小鼠海馬組織線粒體氧化磷酸化功能過度衰退。

Fig.2 Mitochondrial membrane potential in hippocampal tissues of SAMP8 mice during aging圖2 老化因素對SAMP8小鼠海馬組織線粒體膜電位的影響

3 討論

本研究以SAMP8小鼠為老年癡呆動物模型，以SAMR1小鼠為正常老化動物模型，分析了老化過程中SAMP8小鼠海馬組織的關(guān)鍵生物學(xué)變化。利用海馬組織脂筏蛋白質(zhì)組的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SAMP8小鼠海馬組織在老化過程中最關(guān)鍵的細(xì)胞變化是線粒體氧化磷酸化功能的過度衰退，這可能是其癡呆發(fā)生的重要細(xì)胞學(xué)機制。

3.1 脂筏是膜蛋白募集平臺 研究顯示，脂筏在細(xì)胞跨膜信號傳導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用。隨著跨膜信號的活化，脂筏會募集大量相關(guān)功能蛋白到脂筏平臺，組裝成脂筏上的蛋白質(zhì)功能復(fù)合體［7］。通過檢測脂筏募集的蛋白質(zhì)種類能觀察到細(xì)胞活動的關(guān)鍵變化。本研究采用定性蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定脂筏募集的蛋白質(zhì)種類，試圖闡明老化過程中關(guān)鍵的細(xì)胞學(xué)變化。

3.2 線粒體氧化磷酸化功能 本研究顯示，正常老化的SAMR1小鼠中，海馬組織脂筏蛋白質(zhì)組的GO分析和KEGG分析均顯示，線粒體功能相關(guān)蛋白被脂筏大量募集，提示線粒體功能的活化對維持老年小鼠神經(jīng)元細(xì)胞功能有關(guān)鍵作用；而快速老化的SAMP8小鼠中，GO分析顯示，與對照小鼠比較，脂筏募集的線粒體相關(guān)蛋白大幅度減少，富集度大幅度降低，提示老化癡呆的SAMP8小鼠線粒體活動過度衰退。KEGG分析和線粒體膜電位檢測則進(jìn)一步證實，線粒體的氧化磷酸化功能過度衰退是SAMP8小鼠快速老化進(jìn)程海馬神經(jīng)元細(xì)胞的關(guān)鍵變化。

3.3 SAMP8小鼠線粒體功能障礙 線粒體是真核生物細(xì)胞的能量工廠，通過電子傳遞鏈發(fā)生氧化磷酸化過程，為細(xì)胞合成大量三磷酸腺苷（ATP），在能量代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。敏感藥物、細(xì)胞內(nèi)理化變化以及凋亡相關(guān)的跨膜信號途徑的激活均會抑制線粒體功能，引起細(xì)胞內(nèi)ATP合成減少，使細(xì)胞處于能量缺乏狀態(tài)。線粒體功能對各種類型的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)是高度敏感的，細(xì)胞氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也會引起線粒體分裂減少，降低線粒體數(shù)量，引發(fā)線粒體功能衰退。線粒體功能衰退對人類衰老起著推動作用，隨年齡增長，線粒體功能下降成為細(xì)胞衰老的標(biāo)志［8-9］。線粒體功能異常在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，目前已知帕金森病（PD），AD以及亨廷頓?。℉D）等衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病均與線粒體功能障礙相關(guān)［10-11］。介導(dǎo)線粒體自噬過程的PINK1和Parkin信號通路障礙是PD的關(guān)鍵發(fā)病因素，該信號通路障礙會導(dǎo)致缺陷線粒體不能及時被消除，最終導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性缺失，引發(fā)PD。本研究發(fā)現(xiàn)，老化的SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元線粒體的氧化磷酸化功能過度衰退，線粒體膜電位大幅度下降，提示AD海馬神經(jīng)元的功能障礙與PD和HD的細(xì)胞機制相似，均是由神經(jīng)元線粒體能量代謝過度衰退導(dǎo)致ATP的合成障礙引發(fā)的。

3.4 SAMP8小鼠線粒體氧化磷酸化功能與癡呆 線粒體對維持神經(jīng)元的正常功能十分關(guān)鍵。人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)質(zhì)量雖然占全身的比重很小，但耗氧量占的比重卻很大。在神經(jīng)元中，線粒體產(chǎn)生的ATP，一部分用來保證神經(jīng)元正常生命活動的需要，另一部分用于維持神經(jīng)元的細(xì)胞電位，更重要的是，神經(jīng)元的短途物質(zhì)運輸和長途物質(zhì)運輸均需要線粒體參與。在神經(jīng)元突起中，線粒體以細(xì)胞骨架微管為導(dǎo)軌，依靠馬達(dá)蛋白的ATP酶提供動力，大量向突觸前膜區(qū)域遷移聚集，依靠細(xì)胞骨架蛋白的支撐，參與到神經(jīng)遞質(zhì)囊泡的轉(zhuǎn)運和分泌過程，維持神經(jīng)元正常的神經(jīng)遞質(zhì)信號傳遞功能［13］。要滿足這種對能量的巨大需求，中樞神經(jīng)神經(jīng)元需要大量正常功能的線粒體。Morris水迷宮檢測顯示老化的SAMP8小鼠出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記憶障礙，筆者推測隨著快速老化過程中線粒體氧化磷酸化功能的過度衰退，細(xì)胞內(nèi)ATP會減少，SAMP8小鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)的分泌和信號傳遞過程以及突觸功能均產(chǎn)生異常，使小鼠的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能均出現(xiàn)障礙，從而在行為學(xué)上出現(xiàn)明顯的癡呆表型。本研究結(jié)果提示，線粒體氧化磷酸化功能的過度衰退可能是其癡呆發(fā)生的重要細(xì)胞學(xué)機制。