姜楊 ，李永濤 ，徐桂清 ，郭林娜 ，張彧婷 ，沈雷 ，姚立杰 ，王玉

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

肌腱損傷是常見的運動性損傷，疾病多見于大量運動和年齡老化人群，主要表現(xiàn)為肌腱斷裂、腫脹、運動受限，嚴(yán)重影響患者的身體健康。據(jù)報導(dǎo)，全球每年大約有3 000萬肌腱損傷患者，由于肌腱組織缺少血液和細胞，再生修復(fù)能力較弱，很多患者存在嚴(yán)重后遺癥。肌腱治療方法主要是自體肌腱移植、異體肌腱移植、外科手術(shù)治療，但存在異體排斥反應(yīng)、移植后再次斷裂等不良反應(yīng)。目前利用干細胞組織工程移植到損傷肌腱部位修復(fù)技術(shù)日益彰顯良好的診療效果，并有報道其可對損傷肌腱愈合有促進作用[1]。間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）是骨髓主要來源的多向能分化細胞，受到誘導(dǎo)可分化為骨組織、軟骨組織、脂肪組織。多向MSCs是較理想肌腱損傷修復(fù)的種子細胞。SDF-1又稱基質(zhì)細胞衍生因子-1，是CXC類趨化因子，與受體CXCR4受體結(jié)合激活[2]。研究顯示，損傷部位高表達SDF-1可有效募集循環(huán)系統(tǒng)或損傷部位留存的CXCR4激活間充質(zhì)細胞到達損傷部位，修復(fù)受損組織[3]。目前利用組織工程修復(fù)損傷肌腱的研究不是很多，如何招募體內(nèi)MSCs歸巢到組織工程肌腱，促進宿主自身MSCs參與肌腱修復(fù)。如何激發(fā)宿主自身MSCs參與再生修復(fù)、降低免疫排斥反應(yīng)、加速肌腱修復(fù)。該實驗在2017年3月—2018年3月期間利用體外實驗?zāi)M體內(nèi)低氧微環(huán)境觀察一定濃度SDF-1刺激間充質(zhì)干細胞遷移及細胞活性，為臨床研究提供有力的研究支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)基（HyClone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），青鏈霉素（Gibco，美國），胰蛋白酶，4%多聚甲醛，大鼠 SDF-1（Abcam，美國），MTT 試劑盒（Sigma，美國）。

超凈工作臺，CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱，O2/CO2/N2三氣培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），Transwell（Corning，美國），高速離心機（Eppendorf，德國），震蕩儀（躍進儀器廠），Emax酶標(biāo)儀為美國 Molecular Devices。公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物

4～6周齡SD大鼠雄性購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞低氧微環(huán)境 利用三氣培養(yǎng)箱建立低氧微環(huán)境。

1.3.2 間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 大鼠斷頸處死，無菌處理取大鼠股骨兩端剪開，5 mL DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔3～5次，收集細胞懸液1 000 r/s，離心10 min，上清液倒掉，用培養(yǎng)液吹均勻離心管下層組織，在25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，48 h換液，觀察細胞培養(yǎng)瓶有霧狀細胞集落，去除未貼壁細胞，以后每3 d換液。顯微鏡觀察細胞形態(tài)、狀態(tài)，細胞長滿80%～90%進行消化、傳代，使用第3代間充質(zhì)干細胞進行實驗。

1.3.3 實驗分組 低氧環(huán)境下培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞為低氧對照組，在低氧環(huán)境下加入120 ng/mL SDF-1為實驗組，正常環(huán)境下培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞為正常對照組。

1.3.4 Transwell實驗 參考文獻方法[4]，將第3代MSC用0.25%胰酶消化1～2 min，調(diào)整細胞密度1×105cells/mL，Transwell小室的上室加入 200 μL 細胞懸液，24孔板加入120 ng/mL濃度SDF-1的DMEM培養(yǎng)液500 μL，對照組為500 μL DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔，其分別放入37℃和5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)和低氧環(huán)境37℃培養(yǎng)箱，12～15 h進行培養(yǎng)，上室培養(yǎng)液倒掉，PBS沖洗3遍，將聚碳酸酯膜上細胞擦拭掉，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗3遍，20 min蘇木精染色，倒置相差顯微鏡下觀察拍照，每個復(fù)孔隨機選取5個視野進行計數(shù)統(tǒng)計。

1.3.5 MTT實驗 將第3代間充質(zhì)干細胞用胰酶消化1～2 min，1×105cells/mL 種于 96 孔板， 每孔 200 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔。DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，24 h后加入含120 ng/mL SDF-1培養(yǎng)液培養(yǎng)和不含SDF-1培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱和低氧培養(yǎng)箱內(nèi)，每孔加入 5%MTT 20 μL，避光孵育 4 h，然后添加 100 μL二甲基亞砜(DMSO)，490 m波長測定每個樣品吸光度(OD值)。

1.4 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料以（±s）表示，行t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

Transwell細胞遷移實驗:檢測正常對照組、低氧對照組和實驗組間充質(zhì)干細胞的遷移影響。實驗結(jié)果表明細胞遷移率實驗組（43.5±8.4）×103與正常對照組（26.7±5.6）×103比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；低氧對照組（37.5±7.2）×103與正常對照組（26.7±5.6）×103相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 低氧環(huán)境下120 ng/mL SDF-1對MSCs趨化作用

MTT實驗檢測正常對照組、低氧對照組和實驗組間充質(zhì)干細胞活性的影響。在低氧環(huán)境下加入120 ng/mL SDF-1因子對間充質(zhì)干細胞增殖能力。結(jié)果是實驗組加入120 ng/mL SDF-1因子對間充質(zhì)干細胞增殖數(shù)量比較正常對照組和低氧對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 低氧環(huán)境下120 ng/mL SDF-1對MSCs相對吸光度的影響（±s）

表1 低氧環(huán)境下120 ng/mL SDF-1對MSCs相對吸光度的影響（±s）

注：與正常對照組相比較 *P＜0.05，**P＜0.01。

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3 討論

肌腱損傷是目前醫(yī)學(xué)較難解決的問題之一，是運動性損傷治療的瓶頸問題，臨床治療方案主要停留在手術(shù)治療，雖有一定治療效果，但只能恢復(fù)原肌腱力學(xué)的40%，還伴有肌腱斷裂、粘連等一些列并發(fā)癥，給患者帶來較大的身體、心理及精神創(chuàng)傷。近年來，組織工程技術(shù)的日漸成熟，前景廣闊[5]，許多研究者運用干細胞復(fù)合支架來修復(fù)損傷組織、器官。間充質(zhì)干細胞取材簡單方便，易于培養(yǎng)，適應(yīng)生存在微環(huán)境，具有免疫源性低，而且分化能力強，是理想的種子細胞。本實驗通過模擬體內(nèi)肌腱損傷周圍低氧微環(huán)境加入趨化因子SDF-1來觀察間充質(zhì)干細胞遷移能力和活性。目前趨化因子共50多種，有CXC、CC、C和CX3C四大亞家族[6]。SDF-1是應(yīng)用較多是趨化因子，屬于CXC家族，SDF-1與CXCR4結(jié)合，激活受體蛋白，并下一步激活下游蛋白，募集間充質(zhì)干細胞到損傷部位，參與修復(fù)再生。

郝璐等[7]研究發(fā)現(xiàn)：在不加入SDF-1因子低氧環(huán)境下BMSCs遷移能力增強，加入趨化因子SDF-1后BMSCs遷移能力加強。該實驗通過Transwell實驗結(jié)果表明：低氧對照組較正常氧對照組的MSCs遷移效果增強，在加入120 ng/mL濃度SDF-1趨化因子在低氧環(huán)境下MSCs趨化現(xiàn)象也明顯增強于低氧對照組，同時在低氧的環(huán)境下，隨著培養(yǎng)時間的延長MSCs細胞的趨化能力也高于正常氧的環(huán)境。因此，該研究認為SDF-1及低氧環(huán)境對MSCs細胞有趨化作用，進而推測在低氧環(huán)境下及低氧環(huán)境下加入SDF-1因子能夠使MSCs細胞趨化至損傷肌腱部位，從而參與修復(fù)損傷肌腱，為進一步實驗開展提供了實驗依據(jù)。

以往研究資料表明[8]可以利用MTT實驗檢測在不同濃度下 10、50、100 ng/mL和 200 ng/mLSDF-1因子在低氧環(huán)境下細胞的增殖活性。黃曉等[8]報道，在SDF-1濃度小于100 ng/mL時，對BMSCs細胞活力無影響；在SDF-1濃度等于100 ng/mL時，BMSCs細胞活力減弱。該實驗通過MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)：在低氧環(huán)境下加入120 ng/mL濃度SDF-1組細胞增殖活性相對比正常氧MSCs組，低氧SDF-1組細胞增殖活性明顯增高，表明低氧加入120 ng/mL SDF-1能夠有效地加強MSCs細胞增殖活性；低氧對照組細胞增殖活性與正常對照組相比較也有差別，低氧對照組MSCs細胞增殖活性也明顯強于正常對照組。

綜上所述，上述的實驗研究結(jié)果可作為臨床肌腱損傷招募肌腱干細胞歸巢并修復(fù)損傷部位奠定了理論支撐。但SDF-1因子招募細胞歸巢機制目前尚不明確，需要進一步實驗驗證，以及間充質(zhì)干細胞在損傷組織發(fā)揮修復(fù)作用機理等，尚需要進一步討論研究。