楊艷婷，侯向陽(yáng)，魏臻武，喬志宏，常春，任衛(wèi)波，武自念*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225009)

羊草(Leymuschinensis)是歐亞大陸草原具有優(yōu)勢(shì)的牧草和生態(tài)草之一，高產(chǎn)抗逆性強(qiáng)，分布范圍廣，為大多數(shù)畜牧動(dòng)物所喜食，是恢復(fù)退化天然草原和建設(shè)優(yōu)質(zhì)人工草地極其重要的草資源[1]。羊草是歐亞大陸草原區(qū)東部草甸草原及典型草原的重要建群種，作為我國(guó)重要的牧草和生態(tài)草，羊草能適應(yīng)多種環(huán)境條件，具有極豐富的遺傳多樣性，羊草種群之間也產(chǎn)生了不同的遺傳特征[2-3]。探討不同地理種群羊草的遺傳特性對(duì)于研究羊草分化起源及育種等具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。

葉綠體基因是研究植物譜系地理學(xué)、系統(tǒng)學(xué)及種群歷史的首選材料。植物體內(nèi)葉綠體基因進(jìn)化速率較慢，僅為核基因的一半，且葉綠體DNA(chloroplast DNA，cpDNA)為母系遺傳，不會(huì)受基因重組的干擾，進(jìn)化路線相對(duì)獨(dú)立[4-6]。葉綠體DNA非編碼區(qū)的核苷酸替換速率相對(duì)較高，有研究指出，葉綠體非編碼區(qū)因受到的限制較少，能產(chǎn)生比編碼區(qū)更多的變異位點(diǎn)，可以提供較多的具有系統(tǒng)學(xué)意義的信息位點(diǎn)[7-9]。目前,atpB-rbcL、trnL-trnF等葉綠體基因非編碼區(qū)廣泛應(yīng)用于物種遺傳多樣性及譜系地理學(xué)研究。近年來(lái),草本植物基于葉綠體非編碼區(qū)的研究也越來(lái)越多，吳娟子等[10]利用葉綠體基因非編碼區(qū)trnT-trnF序列分析了中國(guó)互花米草(Spartinaalterniflora)不同種群的遺傳結(jié)構(gòu)，趙艷寧[11]利用cpDNA非編碼區(qū)trnL-trnF和trnH-psbA對(duì)短花針茅(Stipabreviflora)11個(gè)居群165個(gè)個(gè)體材料進(jìn)行了分子譜系地理學(xué)研究，楊青松等[12]用cpDNApsbA-trnH序列對(duì)不同海拔的血滿草(Sambucusadnata)進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析。在整個(gè)葉綠體基因組中，非編碼區(qū)在核苷酸替代或插入/缺失突變上，都表現(xiàn)出比編碼區(qū)更快的進(jìn)化速率，受越來(lái)越多的研究者青睞。

目前,人們對(duì)羊草葉綠體基因的研究主要集中在羊草與近緣種之間的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究上。Sun[13]利用rbcL基因分析了披堿草屬與含羊草在內(nèi)的小麥族18個(gè)物種24個(gè)個(gè)體之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示,羊草與新麥草(Psathyrostachysfragilis)之間的親緣關(guān)系較近。羊草是賴草屬的一種，利用葉綠體基因間隔區(qū)進(jìn)行屬內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究也有報(bào)道。Liu等[14]利用核基因ITS序列和葉綠體基因間隔區(qū)trnL-trnF序列對(duì)賴草屬及近緣種13個(gè)物種57個(gè)個(gè)體進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，也得到羊草與新麥草有較近的親緣關(guān)系。Guo等[15]利用葉綠體基因間隔區(qū)trnQ-rps16序列分析了賴草屬25個(gè)物種36個(gè)個(gè)體之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并得到trnQ-rps16序列很有可能是區(qū)分賴草屬進(jìn)化關(guān)系的最佳選擇。利用cpDNA非編碼區(qū)序列研究羊草種內(nèi)遺傳多樣性及進(jìn)化方面的報(bào)道較少，因而篩選出合適的多態(tài)性基因?qū)M(jìn)一步探討羊草種內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化、譜系地理關(guān)系極為重要。

本研究以9個(gè)不同地理位置的羊草居群為材料，分別對(duì)12個(gè)葉綠體非編碼區(qū)DNA片段進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)序列間變異程度分析，試圖從中找出變異相對(duì)豐富的cpDNA片段，并對(duì)所選材料的遺傳多樣性、遺傳分化、基因流、系統(tǒng)發(fā)育樹以及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，為研究羊草群體遺傳學(xué)，探討系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和進(jìn)行譜系地理學(xué)研究，估測(cè)遺傳多樣性中心進(jìn)而保護(hù)羊草種質(zhì)資源，培育高產(chǎn)、抗旱、耐鹽堿優(yōu)良羊草品種等方面的工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2016年8月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所沙爾沁試驗(yàn)基地羊草種質(zhì)資源圃采集9個(gè)羊草居群37個(gè)個(gè)體鮮嫩葉片后液氮速凍(表1)，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?個(gè)羊草居群的材料是來(lái)自不同地理位置的野生種質(zhì)，每個(gè)居群的個(gè)體位置均以該GPS點(diǎn)為中心采樣，個(gè)體之間相距40 m，取整株植株后帶回，種植在羊草種質(zhì)資源圃。

表1 羊草9個(gè)不同地理位置的居群信息Table 1 The information of 9 different geographic populations in L. chinensis

1.2 DNA提取與檢測(cè)

采用植物基因組DNA提取試劑盒提取羊草全基因組DNA，溶于Tris+EDTA(TE)緩沖液后在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)并拍照，存于-20 ℃冰箱備用。植物基因組DNA提取試劑盒(DP-305)購(gòu)自天根生化科技北京有限公司。

1.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50 μL：2*Taq PCR MasterMix 25 μL，引物F、R各3 μL(10 μmol·L-1)，ddH2O 9 μL，DNA 10 μL(約200 ng)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，43～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；10 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)并拍照，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與PCR反應(yīng)引物相同。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表2)。2*Taq PCR MasterMix購(gòu)自天根生化科技北京有限公司。

1.4 序列比對(duì)與分析

使用Seqman軟件讀取序列，去除兩端峰圖信號(hào)雜亂的低質(zhì)量堿基，并進(jìn)行手工拼接和人工校對(duì)。用MEGA 5.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果利用Dnasp 5.10軟件統(tǒng)計(jì)可變位點(diǎn)和簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)；采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并利用Network 5.0軟件進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析；利用GenAlEx 6.5進(jìn)行分子變異分析(analysis of molecular variance,AMOVA)和Mantel檢驗(yàn)；用PERMUT軟件來(lái)計(jì)算居群分化指數(shù)Gst與Nst值，并用1000次置換進(jìn)行檢驗(yàn)；利用Dnasp 5.10進(jìn)行中性檢驗(yàn)，獲得Tajima’sD和Fu’sFs值。

表2 12條葉綠體非編碼區(qū)片段引物信息Table 2 The primer of 12 different chloroplast non-coding fragments

2 結(jié)果與分析

2.1 羊草12條葉綠體序列分析及多態(tài)性篩選

9個(gè)羊草居群37個(gè)個(gè)體的12條葉綠體非編碼區(qū)序列全長(zhǎng)8499 bp，插缺和變異位點(diǎn)數(shù)為99個(gè)，占序列長(zhǎng)度的1.16%；變異位點(diǎn)數(shù)為28個(gè)，簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)16個(gè)，插缺位點(diǎn)12處含2處長(zhǎng)堿基插缺(表3)。序列ndhF-rpl32變異位點(diǎn)數(shù)最多，簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)5個(gè)，分別發(fā)生在105、243、249、363和368 bp處，其次是序列trnL-trnF、trnC-ycf6、aptI-aptH，均有2個(gè)簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)，各序列變異情況不同，整體來(lái)看所選羊草葉綠體非編碼區(qū)序列變異率不高，僅為0.33%。

2.2 基于4條葉綠體非編碼區(qū)片段的羊草種群遺傳多樣性和單倍型多樣性分析

所選羊草材料不同葉綠體非編碼區(qū)片段的遺傳多樣性不同，4條非編碼區(qū)片段合并后全長(zhǎng)3075 bp，單倍型多態(tài)性(Hd)為0.928，核苷酸多態(tài)性(Pi)為0.00101。片段ndhF-rpl32具有相對(duì)較高的遺傳多樣性水平，所有居群的單倍型多態(tài)性(Hd)為0.778，核苷酸多態(tài)性(Pi)為0.00227，核苷酸平均差異數(shù)(K)為1.595(表4)，在4條基因片段中均最高。單倍型多態(tài)性(Hd)和核苷酸多態(tài)性(Pi)最小的序列是trnL-trnF，分別為0.00023、0.158。4條非編碼區(qū)片段合并后共檢測(cè)到15種單倍型，單倍型多樣性方差和標(biāo)準(zhǔn)差分別是0.00035、0.019。

4個(gè)葉綠體非編碼區(qū)片段的Tajima’sD值均為負(fù)值(表4)，且均不顯著(P>0.10)；序列trnL-trnF的D值最低，Tajima’sD=-1.08228，序列trnC-ycf6和aptI-aptH的Tajima’sD值均為-0.69971。序列合并后，Tajima’sD值為-1.08542，F(xiàn)u’sFs值為-5.301，且不顯著(P>0.10)，說(shuō)明羊草在進(jìn)化的過(guò)程中遵循中性進(jìn)化模式，推測(cè)可能經(jīng)歷過(guò)群體擴(kuò)張。

表3 12個(gè)葉綠體非編碼區(qū)片段多態(tài)位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 3 The polymorphism of 12 cpDNA non-coding fragments

注：a處堿基序列為AAATAATATATATGAAAGATATAATAAAGAGAAAAAAA，長(zhǎng)38 bp；b處堿基序列為ATAGATTACTTTTTTATTATTGA，長(zhǎng)23 bp。

Note: The sequence of a is AAATAATATATATGAAAGATATAATAAAGAGAAAAAAA with the length of 38 bp; the sequence of b is ATAGATTACTTTTTTATTATTGA with the length of 23 bp.

表4 基于4條葉綠體非編碼區(qū)片段羊草的遺傳多樣性和單倍型多樣性分析Table 4 The genetic diversity and haplotype diversity analysis in L. chinensis based on 4 cpDNA non-coding fragments

2.3 基于合并序列的不同羊草居群遺傳多樣性和單倍型多樣性分析

4條葉綠體非編碼區(qū)序列合并后羊草9個(gè)居群之間的多態(tài)性表現(xiàn)不同(表5)。居群Pop3、Pop7的遺傳多樣性水平最豐富，居群Pop3的核苷酸多態(tài)性(Pi=0.00153)和平均核苷酸差異(K=4.6667)最高，居群Pop7具有的單倍型數(shù)目最多，且核苷酸多態(tài)性(Pi=0.00105)和平均核苷酸差異(K=3.2)也相對(duì)較高。居群Pop1、Pop5、Pop8、Pop9具有單一的一種單倍型，核苷酸多態(tài)性和單倍型多態(tài)性均為0。

由單倍型分布可以看出，15種單倍型中只有H5被居群Pop3和Pop7共享，H7被居群Pop2、Pop4、Pop7共享，其他的單倍型都是地域特異性地分布在一個(gè)地點(diǎn)的群體中，為各居群所特有，說(shuō)明各居群較為獨(dú)立，可能存在潛在的質(zhì)粒水平的隔離[27]。

表5 基于合并序列9個(gè)羊草居群的遺傳多樣性和單倍型多樣性分析Table 5 The genetic diversity and haplotype diversity analysis of different populations in L. chinensis based on combined sequence

2.4 基于合并序列的不同羊草居群遺傳變異分析

通過(guò)AMOVA 分析可知，羊草居群65%的遺傳變異存在于群體間，35%存在于群體內(nèi)(表6，P<0.01)，居群間遺傳變異大于居群內(nèi)；遺傳分化系數(shù)Fst=0.58884，說(shuō)明羊草居群間存在較大的遺傳分化，居群間變異是羊草的主要變異來(lái)源。根據(jù)基因流(Nm)與Fst之間的關(guān)系：Nm=(1-Fst)/4Fst[28]，得到Nm為0.17，基因流較小。

表6 基于合并序列羊草居群內(nèi)與居群間的分子變異分析Table 6 AMOVA for different populations in L. chinensis based on combined sequence

羊草各居群間的遺傳距離較小，居群Pop3 和Pop8、Pop8和Pop9遺傳距離達(dá)到最大,為0.002，其他各居群之間多為0.001(表7)。居群之間的遺傳分化指數(shù)表明，居群Pop3和Pop7沒(méi)有表現(xiàn)出遺傳分化(-0.093)，居群Pop2和Pop6(0.214)、Pop3和Pop6(0.154)、Pop4和 Pop7(0.178)、Pop6和 Pop7(0.170)遺傳分化較大，其他各居群之間均為高度分化[29](表7)，同時(shí)較小的基因流(0.17)也加劇了居群之間的遺傳分化。

PERMUT軟件分析結(jié)果顯示，羊草所選分布區(qū)居群內(nèi)的平均遺傳多樣性Hs為0.732(0.1401)，居群間總遺傳多樣性Ht為0.956(0.0253)，總的居群分化值Nst0.386(0.1865)大于Gst0.234(0.1506)，差異顯著(P<0.05)，表明羊草居群存在分子譜系地理結(jié)構(gòu)；通過(guò)Mantel檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各居群之間的遺傳距離與地理距離存在顯著相關(guān)性(r=0.449，P<0.05)。

表7 基于合并序列不同羊草居群的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)Table 7 Genetic distance and pairwise fixation indices of genetic variation of different populations in L. chinensis based on combined sequence

注：遺傳距離(對(duì)角線下方)；遺傳分化指數(shù)(Fst，對(duì)角線上方)。

Note: Genetic distance (below diagonal) ; pairwise fixation indices of genetic variation (above diagonal).

2.5 基于合并序列不同單倍型羊草的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 基于合并序列不同羊草居群的系統(tǒng)發(fā)育NJ樹Fig.1 NJ tree of different populations based on combined sequence

基于鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建羊草不同單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。所選37個(gè)羊草個(gè)體15個(gè)單倍型分為兩大分支，其中單倍型H2和H10聚為一大分支，H3和其余單倍型為另一分支；除H2、H10和H3以外的單倍型又分為3小分支，H5、H8和H13聚為一支，H9單獨(dú)聚為一支，其余聚為另一支，其中H4和H6、H11和H12的居群親緣關(guān)系較近，各聚為一支。

2.6 基于合并序列羊草的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析

運(yùn)用中介鄰接網(wǎng)絡(luò)(Median-Joining network，MJ)算法，構(gòu)建羊草不同地理位置種質(zhì)cpDNA單倍型間的關(guān)聯(lián)圖(圖2)。單倍型和中介矢量載體的名稱分別表示為H-和mv。單倍型H3位于分支的軀干上，通過(guò)mv1和mv2將H2和H10、H2和H3連接起來(lái)。H2和H3、H3和H10的居群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；H11和H12、H4和H6的居群親緣關(guān)系較近，與H1、H14和H15聚在H7節(jié)點(diǎn)上；H8、H13與H5的親緣關(guān)系較近；H5、H7和H9共同聚在H3節(jié)點(diǎn)上，親緣關(guān)系較近(圖2)；這與系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果基本一致。

3 討論

3.1 羊草葉綠體非編碼區(qū)的多態(tài)性標(biāo)記

牧草葉綠體基因組大小一般為120～170 kb，基因組通常包括120～130個(gè)基因，其基因容量和基因順序非常保守[28]。本研究羊草葉綠體基因組12條非編碼區(qū)片段共檢測(cè)到40個(gè)變異位點(diǎn)，其中插入/缺失變異位點(diǎn)12個(gè)占總變異的30%。有研究發(fā)現(xiàn)葉綠體基因組核苷酸變異中替換約占70%，插缺突變約占30%，或替換發(fā)生的頻率是插缺變異發(fā)生頻率的3倍[30]，本研究所得的結(jié)果與前人研究大致相同。目前對(duì)插入/缺失產(chǎn)生的機(jī)制和過(guò)程還不是十分清楚，插入/缺失變異的產(chǎn)生過(guò)程比核苷酸替代要復(fù)雜很多，由于測(cè)序產(chǎn)生的誤差和基因組信息的不全，導(dǎo)致插入/缺失突變很難被準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)[31]，故插缺變異的統(tǒng)計(jì)可能存在誤差。

圖2 基于合并序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The network for cpDNA haplotype based on combined sequence 圓圈面積大小與單倍型頻率呈正比，同一單倍型圓圈中的不同顏色代表不同的群體，mv1和mv2表示假定的單倍型節(jié)點(diǎn)。The area of the circle is proportional to the frequency of haplotype; the colors in the same circle represent different populations.

12條葉綠體非編碼區(qū)片段在所選羊草材料上檢測(cè)到不同程度的變異，可能是由各片段進(jìn)化速率不同導(dǎo)致的[23]。其中序列ndhF-rpl32、trnL-trnF、trnC-ycf6、aptI-aptH變異相對(duì)較豐富，在羊草中的進(jìn)化速度相對(duì)較快，是低水平分子研究較好的選擇[32]，這與前人的研究結(jié)果基本一致[17,19]?；騨dhF-rpl32序列位于小單拷貝SSC區(qū)，有相對(duì)較豐富的變異位點(diǎn)，檢測(cè)到5處簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)，推測(cè)其豐富的變異可能是因?yàn)樵谌~綠體基因組DNA復(fù)制過(guò)程中小單拷貝區(qū)的位置較易引入突變。psbA-matK、rpl20-rpl12、trnS-trnG、atpB-rbcL、trnF-ndhJ序列檢測(cè)到的信息位點(diǎn)較少，而劉靜等[33]利用葉綠體基因間隔區(qū)atpB-rbcL序列對(duì)小麥族不同屬的植物進(jìn)行序列變異分析，檢測(cè)到了較多的簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)，約占2.5%。本研究的結(jié)果與之不同，原因可能是不同序列片段在不同類群的物種中得到的變異情況不同，這幾個(gè)序列片段進(jìn)化速率在羊草中相對(duì)較慢。

3.2 羊草的群體遺傳多樣性

一般來(lái)說(shuō)，物種遺傳多樣性受其生存環(huán)境、自然進(jìn)化和本身適應(yīng)能力等因素影響。通過(guò)對(duì)9個(gè)不同地理分布羊草居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，共鑒別出15種單倍型，羊草總體上呈現(xiàn)出較低的遺傳多態(tài)性(Hd=0.928，Pi=0.00101)；Nm值(0.17)小于1，表明羊草各居群的基因交流較小。生殖方式為異交的物種遺傳多樣性一般小于等于0.1，羊草居群的核苷酸多態(tài)性指數(shù)(Pi)僅為0.00101，遠(yuǎn)低于0.1，可能是因?yàn)檠虿轂榭寺≈参?，主要通過(guò)無(wú)性系繁殖，有性生殖能力低下。中性檢驗(yàn)Tajima’sD值和Fu’sFs值均為負(fù)值，在P>0.10水平上不顯著，說(shuō)明羊草在進(jìn)化的過(guò)程中遵循中性進(jìn)化模式，可能經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張，導(dǎo)致其遺傳多樣性較低[34]。羊草單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性在每個(gè)種群間表現(xiàn)不同，推測(cè)可能是由于羊草分布范圍較為廣泛，各種群所處自然環(huán)境條件不同，經(jīng)過(guò)生態(tài)選擇、自然選擇導(dǎo)致不同地理種群羊草的遺傳多樣性有所不同。劉惠芬等[35]對(duì)來(lái)自內(nèi)蒙古草原不同生境8個(gè)羊草種群進(jìn)行RAPD技術(shù)分析得到，較小地理范圍內(nèi)羊草的遺傳分化程度較小，其遺傳分化主要是由環(huán)境的異質(zhì)性所引起，與其生境間的相似度相關(guān)。任文偉等[36]也得到羊草的變異和分化是多種生態(tài)因子綜合作用的結(jié)果(如溫度、海拔、經(jīng)緯度、土壤類型等)，錢吉等[37]發(fā)現(xiàn)水分是影響羊草種群間遺傳變異和生態(tài)型分化的最主要的因子，環(huán)境差異是引起羊草遺傳變異的主要因素。本研究種群Pop3位于山西運(yùn)城市，是地處黃土高原的山地，種群Pop7位于內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市，地貌類型以沙丘、沙地為主要特征，Pop3、Pop7種群的遺傳多樣性水平最豐富，可能與羊草不同地理種群的生活環(huán)境差異較大有關(guān)。

3.3 羊草的群體遺傳結(jié)構(gòu)

植物居群的遺傳結(jié)構(gòu)受群體進(jìn)化歷史、基因流等影響，群體進(jìn)化歷史一般通過(guò)遺傳分化指數(shù)(Fst)來(lái)反映，其大小可在一定程度上揭示種群間基因流和遺傳漂變的程度[38]。一般來(lái)講，當(dāng)Fst<0.05，群體間沒(méi)有遺傳分化；0.050.25，群體間分化程度非常高[29]。羊草居群遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.58884，說(shuō)明群體間遺傳變異較大，分化程度較高。羊草為兼性生殖植物，有一定異交生殖能力，本研究所選羊草材料地理距離較遠(yuǎn)，發(fā)生基因交流的可能性較小，這也加劇居群間遺傳分化的增大；各居群所處環(huán)境的不同，也是產(chǎn)生居群間遺傳變異的原因。AMOVA分析顯示羊草分子變異主要表現(xiàn)在居群間(65%)，且達(dá)到了顯著差異(P<0.01)，這與前人研究結(jié)果不同。Gong等[39]和Wang等[40]分別使用AFLP、RAPD分子標(biāo)記對(duì)羊草進(jìn)行遺傳變異分析，均得到主要變異是發(fā)生在種群內(nèi)。葉綠體DNA比核DNA序列相對(duì)保守，變異速率僅次于核基因組。另外，使用多個(gè)葉綠體分子標(biāo)記相聯(lián)合進(jìn)行分析的方法比使用單一分子標(biāo)記所能提供的有效信息更為全面可靠[41]。本研究選取4個(gè)遺傳變異相對(duì)豐富的葉綠體分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳變異分析，提高了遺傳多樣性檢測(cè)的靈敏度，更加客觀地反映了羊草各地理居群的遺傳結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

本研究從羊草12條葉綠體非編碼區(qū)中篩選出ndhF-rpl32、trnL-trnF、trnC-ycf6、aptI-aptH4條序列變異相對(duì)較高，可作為下一步探討羊草野生群體譜系地理關(guān)系與進(jìn)化歷程理想的分子標(biāo)記；羊草遺傳多樣性水平較低(Hd=0.928，Pi=0.00101)，基因流較小(Nm=0.17)，遺傳分化程度較高(Fst=0.58884)，遵循中性進(jìn)化理論，可能經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張；各居群遺傳距離與地理距離相關(guān)性顯著，存在分子譜系地理結(jié)構(gòu)。