謝巧 栗圣榕 廖莉 顏成功 張廷模 夏厚林

中圖分類號(hào) R284.2；R282.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）17-2376-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.17

摘 要 目的：研究切片、切段對(duì)疊鞘石斛中多糖、聯(lián)芐類化合物及石斛酚提取量的影響，比較疊鞘石斛切片、切段的優(yōu)劣。方法：將疊鞘石斛燀蒸后切制成長度為10 mm的段及厚度為4 mm的片，于60 ℃烘干，然后將疊鞘石斛片（段）煎煮60、90、120 min及溫浸60、90 min；采用紫外-可見分光光度法測(cè)定其在煎煮及溫浸過程中多糖、聯(lián)芐類化合物提取量，采用高效液相色譜法測(cè)定疊鞘石斛片（段）中石斛酚的提取量；另計(jì)算浸出物提取率。結(jié)果：在煎煮過程中，疊鞘石斛片較石斛段多糖、聯(lián)芐類化合物提取量分別增加了0.06～0.17、0.08～0.11 mg/g，石斛酚提取率增高了37.5%；在溫浸過程中，疊鞘石斛片較石斛段多糖、聯(lián)芐類化合物提取量分別增加了0.33～0.58、0.17～0.28 mg/g；疊鞘石斛片較石斛段的水溶性浸出物及醇溶性浸出物提取率分別增高了2.89%、0.98%。結(jié)論：疊鞘石斛切片優(yōu)于切段，本研究可為《中國藥典》中石斛切制時(shí)改段為片提供一定的參考。

關(guān)鍵詞 疊鞘石斛；切片；切段；多糖；聯(lián)芐類化合物；石斛酚

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of slice and segment on the extraction amount of polysaccharides， bibenzyl compounds and dendrophenol from Dendrobium denneanum， and to compare the advantages and disadvantages of D. denneanum slice and segment. METHODS： The steamed D. denneanum was cut into segment with length of 10 mm and slice with thickness of 4 mm， and then dried at 60 ℃. Then D. denneanum slice （segment） decocte 60， 90， 120 min and warm-soak 60， 90 min， UV spectrophotometry was used to determine the extraction amount of polysaccharides and bibenzyl compounds from it. HPLC method was used to determine the extraction amount of dendrophenol from D. denneanum slice （segment）， and calculate the extraction rate of it separately. RESULTS： Compared with D. denneanum segment， the extraction amount of polysaccharides and bibenzyl compounds in D. denneanum slice were increased by 0.06-0.17 mg/g and 0.08-0.11 mg/g during decocting， and the extraction rate of dendrophenol was increased by 37.5%. During the warm-soaking process， compared with D. denneanum segment， extraction amount of polysaccharides and bibenzyl compounds in D. denneanum slice were increased by 0.33-0.58 mg/g and 0.17-0.28 mg/g， respectively. Compared with D. denneanum segment the extraction rates of water-soluble extracts and alcohol-soluble extracts in D. denneanum slice were increased by 2.89% and 0.98%， respectively. CONCLUSIONS： D. denneanum slice is superior to D. denneanum segment， which provides reference for changing segment into slice about the cutting of D. denneanum in Chinese Pharmacopeia.

KEYWORDS Dendrobium denneanum； Slice； Segment； Polysaccharides； Bibenzyl compounds； Dendrophenol

石斛是一種名貴中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有益胃生津、滋陰清熱的功效?，F(xiàn)代研究表明，石斛具有抗氧化[1-3]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[4]、抗腫瘤[5]等活性。石斛常用品種有金釵石斛、鼓槌石斛以及流蘇石斛及其近似品種[收載于2015年版《中國藥典》（一部）[6]]、環(huán)草石斛、黃草石斛和馬鞭石斛（收載于《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》2005年版[7]）、疊鞘石斛（收載于《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2010年版[8]）等。疊鞘石斛[Dendrobium aurantiacum Rchb.var.denneanum （Kerr.） Z.H.Tsi.]是蘭科植物疊鞘石斛栽培品的新鮮或干燥莖[8]，為石斛的近似種，是四川省著名道地藥材“嘉定石斛”的主要品種[9]，具有地方特色，在四川省樂山市夾江縣已廣為栽培并供藥用，且在廣東、廣西、貴州等地常作為石斛藥材臨床使用[10]，在全國資源量較大，選擇疊鞘石斛進(jìn)行研究具有一定的代表性。

由于加工器械的限制，過去石斛的切制主要采用切段，故《中國藥典》1953-2015年版中石斛皆切制為段。文獻(xiàn)研究表明[11-12]，石斛在地方標(biāo)準(zhǔn)中還可切片使用，如《浙江省中藥炮制規(guī)范》2005年版對(duì)石斛除切段外還可切厚片（2～4 mm）等。本課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，石斛切段雖簡(jiǎn)便，但在煎煮浸泡時(shí)有不易過芯、易漂浮在水面、有效成分煎出率低（石斛酚煎出率僅為0.015%～0.067%）等缺點(diǎn)，可見，《中國藥典》中對(duì)石斛進(jìn)行切段處理可對(duì)石斛這一貴重藥材造成一定的浪費(fèi)。因此，從完善石斛切制方法、提高藥材利用率的角度出發(fā)，本研究選擇疊鞘石斛為研究對(duì)象，以疊鞘石斛中有效成分多糖、聯(lián)芐類化合物的總量及聯(lián)芐類單體石斛酚為指標(biāo)比較疊鞘石斛切片切段的優(yōu)劣，為《中國藥典》中石斛切制改段為片提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；BS-124S電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；SB-5200DTD 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠）；L-550臺(tái)式低速大容量離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

疊鞘石斛藥材（批號(hào)：D20161018w2，于2016年10月購于四川萬安石斛產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室盧先明教授鑒定為蘭科石斛屬植物疊鞘石斛。將采集的新鮮疊鞘石斛洗凈后于沸水中燀2 min，去除葉片，切制成長度為10 mm的段及厚度為4 mm的片，并于60 ℃烘干，備用[12]。按《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2010年版疊鞘石斛項(xiàng)下方法檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)均合格[8]）；葡萄糖對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：P-012-150730，純度：>98%）；石斛酚對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq16081604，純度：>95%）；福林酚（批號(hào)：2016062201）、無水碳酸鈉（批號(hào)：2016041601，分析純）、干酪素（批號(hào)：2015050801，化學(xué)純）均購自成都市科龍化工試劑廠；硫酸（四川西隴化工有限公司，批號(hào)：170303，分析純）；苯酚（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：2015091501，分析純）；其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 疊鞘石斛片、段吸水率的測(cè)定

采用自然過濾法[13]。稱取疊鞘石斛片、段各5 g，記錄藥材飲片原始質(zhì)量（m），分別浸泡30、40、50、60 min時(shí)濾出藥材，過篩，稱質(zhì)量，得出吸水后的藥材質(zhì)量（mi），并根據(jù)公式[吸水率（%）=（mi-m）/m×100%]計(jì)算吸水率。疊鞘石斛片、段吸水率測(cè)定結(jié)果詳見表1。

由表1可知，浸泡相同時(shí)間，疊鞘石斛片、段吸水率差異較大，相比于疊鞘石斛段，疊鞘石斛片更易浸泡過芯。

2.2 溫浸液和煎煮液的制備

2.2.1 溫浸液的制備 參照鐵皮石斛楓斗日常服用方式進(jìn)行試驗(yàn)[14]。稱取疊鞘石斛片、段各3 g（各2份），分別置于250 mL圓底燒瓶中，加入80 ℃熱水200 mL，密塞，于80 ℃水浴條件下分別保溫浸泡60、90 min后過濾，即得。

2.2.2 煎煮液的制備 參照中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行試驗(yàn)[15]。稱取疊鞘石斛片、段各5 g（各3份），分別置于250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL水浸泡60 min，然后分別回流煎煮60、90、120 min后過濾，并將各續(xù)濾液定容至50 mL，即得。

2.3 多糖提取量的測(cè)定

參照本課題組前期建立的疊鞘石斛多糖含量測(cè)定方法[16]進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定葡萄糖對(duì)照品6.98 mg，置于10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，得貯備液；再精密吸取1 mL貯備液，加水定容至5 mL，得質(zhì)量濃度為139.6 ?g/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取“2.2”項(xiàng)下溫浸液2 mL（煎煮液0.5 mL，加水補(bǔ)至2 mL），加入10 mL無水乙醇，搖勻，4 ℃冷藏60 min后4 000 r/min離心20 min（離心半徑9.6 cm），棄去上清液，沉淀加8 mL 80%乙醇洗滌2次后加熱水溶解，放冷，再轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.05、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，分別加水補(bǔ)至1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL（臨用配制），搖勻，再精密加入硫酸5 mL，搖勻，置于沸水浴中加熱20 min，取出，置于冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，于紫外-可見分光光度計(jì)488 nm波長處測(cè)定吸光度值。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、吸光度值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.009 9x-0.062 5（R2=0.999 7）。結(jié)果表明，多糖檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為6.86～112.15 ?g/mL。

2.3.4 提取量的測(cè)定 精密量取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法分別測(cè)定疊鞘石斛片、段經(jīng)煎煮和溫浸兩種過程的多糖提取量，平行測(cè)定3次。對(duì)比分析疊鞘石斛片、段經(jīng)煎煮和溫浸兩種過程多糖的提取量，結(jié)果詳見圖1。

由圖1可知，煎煮過程疊鞘石斛片的多糖提取量高出疊鞘石斛段0.06～0.17 mg/g，溫浸過程疊鞘石斛片的多糖提取量高出疊鞘石斛段0.33～0.58 mg/g；可見，經(jīng)溫浸和煎煮后疊鞘石斛片的多糖提取量皆優(yōu)于疊鞘石斛段。

2.4 聯(lián)芐類化合物提取量的測(cè)定

參照本課題組建立的疊鞘石斛聯(lián)芐類化合物總量測(cè)定方法[17-18]進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定石斛酚對(duì)照品5.02 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為1.004 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密量取“2.2”項(xiàng)下溫浸液（煎煮液）3 mL，加入0.01 g干酪素，再置于30 ℃水浴中保溫1 h（隨時(shí)振搖），取出，放冷，濾過；取續(xù)濾液400 ?L，加水補(bǔ)至1 mL，即得。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取1.004 mg/mL石斛酚對(duì)照品溶液0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mL，分別置于10 mL具塞試管中，各加水補(bǔ)至1 mL；精密加入1 mL福林酚試劑，搖勻，加入5 mL 10% Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，于30 ℃水浴中反應(yīng)60 min，取出；以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照，于紫外-可見分光光度計(jì)760 nm波長處測(cè)定吸光度值。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、吸光度值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.013x- 0.019 7（R2=0.999 7）。結(jié)果表明，聯(lián)芐類化合物檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為10.74～90.53 ?g/mL。

2.4.4 提取量的測(cè)定 精密量取“2.4.2”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，按“2.4.3”項(xiàng)下方法測(cè)定疊鞘石斛片、段經(jīng)煎煮和溫浸后聯(lián)芐類化合物提取量，平行測(cè)定3次。對(duì)比分析疊鞘石斛片、段經(jīng)煎煮和溫浸后聯(lián)芐類化合物的提取量，結(jié)果詳見圖2。

由圖2可知，煎煮后疊鞘石斛片中的聯(lián)芐類化合物提取量高出石斛段0.08～0.11 mg/g，溫浸后疊鞘石斛片中聯(lián)芐類化合物的提取量高出疊鞘石斛段0.17～0.28 mg/g；可見，經(jīng)煎煮和溫浸后疊鞘石斛片的聯(lián)芐類化合物提取量皆優(yōu)于疊鞘石斛段。

2.5 石斛酚的含量測(cè)定

參照本課題組建立的石斛酚含量測(cè)定方法[19]進(jìn)行試驗(yàn)。

2.5.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：乙腈-水-甲酸（35 ∶ 65 ∶ 0.1，V/V/V）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 ?L。

2.5.2 供試品溶液的制備 取疊鞘石斛片、段各5 g，分別置于250 mL圓底燒瓶中，加50 mL水，浸泡60 min，回流煎煮2 h，濾過；取續(xù)濾液蒸干，甲醇溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中定容，搖勻，過濾，即得。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取石斛酚對(duì)照品5.01 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，再稀釋成質(zhì)量濃度為1、2、5、10、100、200、500 ?g/mL的對(duì)照品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=17.605x-0.42（R2=0.999 9）。結(jié)果表明，石斛酚檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為1.02～499.40 ?g/mL。

2.5.4 石斛酚提取量的測(cè)定 取“2.5.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定疊鞘石斛片、段中石斛酚提取量并進(jìn)行分析，平行測(cè)定3次，結(jié)果詳見表2。

由表2可知，煎煮后疊鞘石斛片中的石斛酚提取量高于疊鞘石斛段。

2.6 浸出物提取率的測(cè)定

參照2015年版《中國藥典》（四部）中“浸出物測(cè)定法”項(xiàng)下方法[20]測(cè)定疊鞘石斛片、段中水溶性浸出物和醇溶性浸出物提取率，平行測(cè)定3次。兩種浸出物提取率結(jié)果見表3。

由表3可知，疊鞘石斛片水溶性浸出物和醇溶性浸出物提取率均高于疊鞘石斛段。

3 討論

疊鞘石斛藥材的莖呈細(xì)長圓柱形，長20～63 cm，直徑0.3～1.2 cm，2015年版《中國藥典》（一部）收載的金釵石斛直徑0.4～0.6 cm，鼓槌石斛中部直徑1～3 cm，流蘇石斛直徑0.4～1.2 cm，可見疊鞘石斛莖的直徑范圍較寬，選擇疊鞘石斛作切片、切段對(duì)比研究具有一定的代表性。

王再花等[21]檢測(cè)疊鞘石斛、杯鞘石斛、齒瓣石斛、重唇石斛、鉤狀石斛、鐵皮石斛、細(xì)莖石斛、金釵石斛、報(bào)春石斛等35種品種，發(fā)現(xiàn)石斛中生物堿含量較低，大約為0～0.638%。多糖類成分是石斛屬植物含量最高的成分，是其增強(qiáng)免疫力、降低血糖以及抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。石媛慧[22]在疊鞘石斛與腫節(jié)石斛、反瓣石斛、翅萼石斛、翅梗石斛的對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)其多糖含量范圍為2.06%～8.73%，其中疊鞘石斛多糖含量高達(dá)5.81%。聯(lián)芐類化合物是石斛抗腫瘤作用的主要活性成分，也是鐵皮石斛、鼓槌石斛等具有抗腫瘤活性的有效成分之一[5]，含有聯(lián)芐類化合物的石斛品種有束花石斛、鼓槌石斛、疊鞘石斛、流蘇石斛等。賈芳等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，采用紫外分光光度法測(cè)定疊鞘石斛中聯(lián)芐類化合物含量穩(wěn)定性較好，其含量范圍為0.47%～0.67%。疊鞘石斛聯(lián)芐類化合物主要有石斛酚、杓唇石斛素和鼓槌聯(lián)芐等，石斛酚為其特征性成分[23]，一般將石斛酚作為聯(lián)芐類的指標(biāo)性化合物進(jìn)行定性或定量研究[24]。因此，本研究選擇多糖、聯(lián)芐類化合物以及石斛酚的提取量為指標(biāo)進(jìn)行疊鞘石斛切片、切段的比較研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，疊鞘石斛中石斛酚煎出率較低，僅為0.015%～0.067%，在煎煮過程及溫浸過程中檢測(cè)到的石斛酚響應(yīng)信號(hào)較弱，較難進(jìn)行分步測(cè)算，故本試驗(yàn)中選擇回流煎煮2 h測(cè)定石斛酚單體的提取總量。

本研究也對(duì)煎煮過程和溫浸過程中多糖、聯(lián)芐類化合物的提取量進(jìn)行考察。傳統(tǒng)中藥多煎煮服用，因此本試驗(yàn)重點(diǎn)考察煎煮過程?？疾旒逯蠛蠖嗵?、聯(lián)芐類化合物、石斛酚的提取量以及浸出物的提取率。補(bǔ)充溫浸試驗(yàn)，主要是體現(xiàn)石斛日常茶飲習(xí)慣，參照文獻(xiàn)選擇了60、90 min這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行考察[13]，溫浸過程溶出的多糖、聯(lián)芐類化合物總量高于煎煮過程，其原因是溫浸過程加水量大，使得有效成分溶出量相對(duì)較多。

疊鞘石斛片經(jīng)煎煮后多糖、聯(lián)芐類化合物以及石斛酚的提取量均高于疊鞘石斛段，經(jīng)溫浸后多糖、聯(lián)芐類化合物提取量?jī)?yōu)于疊鞘石斛段，其原因是由于疊鞘石斛片較易浸泡過芯。浸出物可以表征去除水溶性多糖和其他醇不溶性成分后的其他物質(zhì)含量，本試驗(yàn)也得出疊鞘石斛片的水溶性浸出物及醇溶性浸出物的提取率均高于疊鞘石斛段。

綜合分析試驗(yàn)結(jié)果可知，疊鞘石斛切片優(yōu)于切段，本試驗(yàn)結(jié)果為《中國藥典》石斛藥材切制改段為片提供了一定的參考價(jià)值。

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（收稿日期：2018-01-30 修回日期：2018-03-30）

（編輯：劉 萍）