□ 于家豐 遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心

本文提供了液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（LC—MS）檢測飼料原料中維生素A、維生素D3、維生素E的方法，該檢測方法可以實現(xiàn)維生素A、維生素D3、維生素E的聯(lián)檢，且LC—MS方法靈敏度較高，比現(xiàn)行高效液相色譜法高1000倍以上。LC—MS方法可應用于飼料原料、糧食、農(nóng)產(chǎn)品、食品等維生素A、維生素D3、維生素E含量很低的樣品的檢測。該方法在0.1～100IU/L的濃度范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標準曲線R2＞0.999；維生素A、維生素D3、維生素E的回收率均達到80.0%～110%，相對偏差不大于15%。

現(xiàn)行的飼料中維生素A、維生素D3、維 生 素 E（ 以 下 簡 稱“VA、VD3、VE”）的檢測方法均為液相色譜法，其中VA的檢測方法為GB/T 17817-2010， 定 量 限 為 1000IU/kg；VD3檢測方法為GB/T 17818-2010，定量限為500IU/kg；VE的檢測方法為GB/T 17812-2008，定量限為1IU/kg。飼料原料中VA、VD3、VE含量在方法的定量限之下時，上述方法無法準確檢出它們的含量。雖然飼料原料中VA、VD3、VE的含量很低，但由于飼料原料的添加比例很大，因此飼料中VA、VD3、VE的總量十分很可觀，故研究適用于飼料中VA、VD3、VE低含量的檢測方法是一件十分有價值的工作。

1 研究內(nèi)容

1.1 優(yōu)化前處理方法

1.1.1 皂化反應溶液需先離心：皂化反應后的樣液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心取上清液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，防止樣品殘渣堵塞分液漏斗。

1.1.2 用石油醚代替乙醚：石油醚的提取效率和乙醚的提取效率基本相同，且因為石油醚的毒性低于乙醚，因此用石油醚代替乙醚。

1.2 考查線性相關(guān)性

用甲醇溶液配置VA、VD3、VE工作液，其系列濃度分別為0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L。相同條件下，用串聯(lián)質(zhì)譜檢測上述曲線各點的峰面積，VA的濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)為0.9998，VD3的濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)為0.9999，VE的濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)為0.9995。

1.3 凈化小柱的選擇

根據(jù)VA、VD3、VE的性質(zhì)特點，應選取吸附特性為非極性的凈化小柱。經(jīng)查閱資料，選擇安捷倫公司提供的Bond Elut ENN、Bond Elut LMS、Bond Elut ENV、Bond Elut PLEXA 4種凈化小柱。筆者分別考察并進行了VA、VD3、VE過凈化小柱的回收率，其中，Bond Elut PLEXA凈化小柱VA、VD3過柱回收率達到99%，VE過柱回收率達到93%。結(jié)果表明，Bond Elut PLEXA小柱可以實現(xiàn)飼料中VA、VD3、VE的凈化。

1.4 洗脫液的選擇

筆者分別考察了乙腈、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、正己烷、甲基異丁酮的洗脫效果，回收率表明：用丙酮做洗脫液，VA、VD3過柱回收率達到100%，VE過柱回收率達到98%，因此選擇丙酮做洗脫液。

1.5 凈化程序

用3mL 80%甲醇水溶液活化小柱，適量樣液上柱，再用3mL 80%甲醇水溶液淋洗小柱，抽干，3mL丙酮洗脫，50℃氮氣吹干，甲醇溶液復溶，過膜，供LC-MS檢測。

1.6 儀器條件的確定

1.6.1 色譜條件的選擇

本實驗采用實驗室常用的C18色譜柱，以甲醇、水作為流動相進行研究。由于 VA、VD3、VE中含有氮原子和氧原子，易于接受氫質(zhì)子，因此質(zhì)譜檢測方式選用正離子模式。經(jīng)實驗比較發(fā)現(xiàn)，選用C18色譜柱（柱長100mm，內(nèi)徑2.1mm， 粒 徑 2.4μm）、0.2%甲酸水溶液和甲醇作為流動相，得到的色譜峰對稱性好，無拖尾現(xiàn)象，待測物與樣品中的雜質(zhì)分離效果理想。

液相色譜條件為，色譜柱：C18柱、柱長100mm、內(nèi)徑2.1mm、粒徑2.4μm；流動相：A相為甲醇，B相為0.2%甲酸水溶液,梯度洗脫（見表1）；柱溫：40℃；進樣量：10μL。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.6.2 質(zhì)譜條件的選擇

由于儀器廠家不同，質(zhì)譜各參數(shù)也不一致，其參考條件如下。離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；毛細管電壓、碰撞能量等參數(shù)應優(yōu)化至最佳靈敏度；定性離子對、定量離子對等參數(shù)見表2。

表2 VA、VD3、VE的定性、定量離子對及碰撞能量參考值

表3 VA、VD3、VE的添加回收試驗一覽表

1.7 樣品基質(zhì)效應對回收率的影響

準確移取VA、VD3、VE標準溶液適量，分別加入6份空白樣品中。經(jīng)提取、凈化及濃縮后，加甲醇溶液定容，充分混勻，制得濃度為0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L的基質(zhì)匹配標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.8 飼料原料加標回收試驗

選擇典型的飼料原料，包括玉米面、米糠、小麥麩、棉粕，回收結(jié)果為80%～110%。回收試驗表明，該方法定量檢測對飼料原料均有較好的適用性（見表3）。

1.9 部分飼料原料檢測結(jié)果

對米面、米糠、小麥麩、棉粕4種植物性飼料原料進行了檢測。4種植物性飼料原料中維生素E的含量較高，其中，米糠的含量最高，達到了39.88IU/kg；小麥粉次之，達到了20.25IU/kg；棉粕的含量最低，為3.354IU/kg。4種植物性的飼料原料中VA、VD3均未檢出，檢測結(jié)果見表4。

表4 部分飼料原料的檢測結(jié)果一覽表

1.10 檢出限與定量限

空白飼料中VA、VD3、VE添加濃度為0.5IU/kg,信噪比＞10，因此定量限確定為0.5IU/kg?？瞻罪暳现蠽A、VD3、VE添加濃度為0.1IU/kg，信噪比＞3，因此檢出限確定為0.1IU/kg。

2 討論

2.1 飼料原料中維生素E的含量不能被忽略

農(nóng)業(yè)部2625號公告給出配合飼料中VE推薦添加量。由表4可知，如果配合飼料中添加一定比例的米糠、小麥粉等飼料原料，飼料配方設計中外源性VE添加量為飼料配方設計的VE理論添加量減去飼料原料中VE含量，且外源性VE的添加量會一定程度地減少。在飼料生產(chǎn)實踐過程中節(jié)約了VE的添加成本，提高了飼料加工生產(chǎn)效益。

表5 農(nóng)業(yè)部2625號公告給出配合飼料中維生素E推薦添加量

2.2 皂化過程對VA、VD3、VE有一定的破壞作用，因此，要用經(jīng)過皂化反應的VA、VD3、VE的對照品來定量。

2.3 要注意基質(zhì)效應，飼料原料中VA、VD3、VE的檢測是有一定的基質(zhì)效應的，因此要充分考慮樣品的基質(zhì)效應，飼料原料基質(zhì)效應見表6。

3 研究結(jié)果

維生素A的濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)為0.9998，維生素D3的濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)為0.9999，維生素E的濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)為0.9995。方法定量限為0.5IU/kg，方法檢出限為0.1IU/kg。相對偏差小于20%。回收率在80%～110%?；厥赵囼灡砻?，該方法適合飼料原料中維生素A、維生素D3、維生素E的檢測。

表6 飼料原料基質(zhì)效應一覽表