徐琛善，吳楠，海霞，王軍，田佳，劉香檬，鮑振博，彭錦星

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中紅外光譜快速檢測(cè)牛奶中土霉素的可行性研究

徐琛善，吳楠通信作者，海霞，王軍，田佳，劉香檬，鮑振博，彭錦星

（天津農(nóng)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384）

將中紅外光譜技術(shù)與偏最小二乘判別法相結(jié)合，建立一種牛奶中殘留土霉素的快速檢測(cè)方法。配置62個(gè)純牛奶和62個(gè)摻雜有不同濃度土霉素（所摻土霉素濃度區(qū)間為0.02～30.00 mg/L）的牛奶樣品，在400～4 000 cm-1區(qū)間進(jìn)行中紅外光譜采集。對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理之后，分別在全波段和分波段區(qū)間內(nèi)建立偏最小二乘判別模型，并進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果顯示，不同波數(shù)區(qū)間建模對(duì)摻雜土霉素牛奶的預(yù)判模型有較大影響。全波段和分波段區(qū)間所建模型對(duì)校正集樣品的判別正確率均達(dá) 100%，預(yù)測(cè)集樣品建模相關(guān)系數(shù)在0.995～0.997之間，表明所建模型的擬合效果良好，其中全波段和2 000～4 000 cm-1波段內(nèi)所建模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣品的判別正確率均達(dá)90.0%。

牛奶；抗生素；中紅外光譜；偏最小二乘判別分析

隨著人們生活水平的提高，世界各地牛奶的消耗量持續(xù)增長(zhǎng)。然而部分不合格牛奶中檢測(cè)到的有害物質(zhì)（如抗生素、三聚氰胺和尿素等）嚴(yán)重危害人體健康，引起消費(fèi)者對(duì)牛奶食品安全的關(guān)注。土霉素屬于四環(huán)素類(lèi)抗生素，具有廣譜抗病原微生物作用，是一種快速抑菌劑，高濃度時(shí)具有殺菌作用。土霉素類(lèi)藥物常被用于治療奶牛的各種炎癥，可導(dǎo)致牛奶中土霉素的殘留。殘留在牛奶中的土霉素可能引起人們過(guò)敏，或在牛奶食品加工過(guò)程中抑制發(fā)酵劑的活性，進(jìn)而導(dǎo)致乳制品工業(yè)損失。目前，牛奶中抗生素殘留物質(zhì)的分析方法有很多種，如傳統(tǒng)的微生物法、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法（HPLC-UV）、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（HPLC-FLD）和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）等。張俊升等[1]利用固相萃取前處理，結(jié)合高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器方法檢測(cè)牛奶中土霉素、金霉素的殘留量。汪善良等[2]比較了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜與膠體金試紙條兩種方法對(duì)牛奶中殘留土霉素等四環(huán)素類(lèi)藥物的檢測(cè)，檢測(cè)限在40～80 μg/L之間。

雖然色譜及質(zhì)譜技術(shù)在牛奶抗生素殘留檢測(cè)方面較為成熟，能達(dá)到較低的檢測(cè)限，但前處理過(guò)程較復(fù)雜。近年來(lái)，光譜技術(shù)作為新興的一種無(wú)損、快速檢測(cè)技術(shù)，也被用于牛奶中抗生素殘留檢測(cè)，如近紅外光譜法、中紅外光譜法、熒光光譜法等。Sivakesava等[3]采用中紅外（Mid infrared，MIR）和近紅外（Near infrared，NIR）光譜法對(duì)牛奶中四環(huán)素進(jìn)行了無(wú)損檢測(cè)。在不同濃度范圍內(nèi)（4～520，520～2 000和4～2 000 μg/L）分別建模，并進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證模型的相關(guān)系數(shù)R為0.61～087，研究發(fā)現(xiàn)，中紅外法檢測(cè)牛奶中四環(huán)素的預(yù)測(cè)誤差要低于近紅外法。Wu等[4]用近紅外光譜法對(duì)牛奶中殘留的四環(huán)素進(jìn)行了定性和定量分析，校正集和預(yù)測(cè)集的正確判別率分別達(dá)到100.0%和96.3%。由于紅外光譜技術(shù)不需要復(fù)雜的樣品前處理，操作簡(jiǎn)單，成本低，可對(duì)樣品實(shí)現(xiàn)原位檢測(cè)，也被廣泛用于乳制品中其他摻雜物質(zhì)（如三聚氰胺）的檢測(cè)[5]。

偏最小二乘判別分析法（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，根據(jù)實(shí)際測(cè)量出的眾多變量值，來(lái)判斷研究對(duì)象如何分類(lèi)。通過(guò)對(duì)不同處理樣本（如觀測(cè)樣本、對(duì)照樣本）的特性分別進(jìn)行訓(xùn)練，產(chǎn)生校正集，并檢驗(yàn)校正集的準(zhǔn)確率。本文采用中紅外光譜結(jié)合偏最小二乘判別法對(duì)牛奶中殘留的土霉素進(jìn)行檢測(cè)，建立土霉素?fù)诫s牛奶和純牛奶的判別模型，并研究不同波數(shù)建模區(qū)間對(duì)判別模型的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

樣品為在網(wǎng)上超市購(gòu)買(mǎi)的某品牌同一批次的純牛奶。土霉素標(biāo)品粉末購(gòu)自Solarbio（純度＞99%）。配制31個(gè)不同濃度梯度的土霉素?fù)诫s牛奶，質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、18、20、25、30 mg/L。每個(gè)濃度梯度設(shè)2個(gè)重復(fù)，共62個(gè)樣品。同時(shí)準(zhǔn)備62個(gè)純牛奶樣品。用中紅外儀器對(duì)這124個(gè)樣品的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。

1.2 光譜采集

采用美國(guó) PerkinElmer 公司的傅里葉變換中紅外光譜儀，樣品池為儀器自配的衰減全反射附件。中紅外光譜的掃描范圍為 400～4 000 cm-1，分辨率為 4 cm-1，掃描間隔為8 cm-1，掃描次數(shù)為 8次，每個(gè)濃度樣品測(cè)量?jī)纱巍?/p>

1.3 分析方法

利用unscrambler分析程序，對(duì)輸入的摻雜牛奶光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正，采用 Savitzky- Golary 方法對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑預(yù)處理，以減少對(duì)判別模型的干擾。然后采用PLS算法的Matlab程序包建立摻雜土霉素牛奶的判別模型。利用交互驗(yàn)證（cross-validation）的方法來(lái)確定模型的最佳主成分?jǐn)?shù)，利用測(cè)定值與模型計(jì)算值之間的建模相關(guān)系數(shù)（），內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差（Root mean square errors of cross validation，RMSECV），預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)（），預(yù)測(cè)均方差（Root mean square errors of prediction，RMSEP）等指標(biāo)評(píng)定模型的質(zhì)量[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 純牛奶和摻雜土霉素牛奶的中紅外光譜圖

圖1是純牛奶和摻雜土霉素牛奶樣品的中紅外光譜圖。整個(gè)光譜范圍內(nèi)，摻雜牛奶和純牛奶譜峰出現(xiàn)的位置基本相同，大致出現(xiàn)在1 080 cm-1和2 920 cm-1左右，看不出摻雜土霉素的明顯特征。這表明簡(jiǎn)單的通過(guò)光譜形狀和譜峰位置很難判別牛奶中是否摻雜土霉素，故需要進(jìn)一步借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法來(lái)進(jìn)行判別。

圖1 純牛奶和摻雜土霉素牛奶的中紅外光譜圖

2.2 全波段分析

對(duì)主成分?jǐn)?shù)的設(shè)定會(huì)直接影響PLS-DA的建模結(jié)果，如果設(shè)定的主成分?jǐn)?shù)過(guò)高，會(huì)引入一些無(wú)用信息，同時(shí)延長(zhǎng)建模時(shí)間；如果設(shè)定的主成分?jǐn)?shù)過(guò)低，則可能因?yàn)槿笔б恍┯杏眯畔⒍鴮?dǎo)致模型預(yù)測(cè)能力降低[6]。由于主成分分析依賴(lài)所給數(shù)據(jù)，所以數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性對(duì)分析結(jié)果影響也很大，因此分析之前剔除了數(shù)據(jù)中的異常值。圖2是PLS-DA模型的隨主成分?jǐn)?shù)變化的散點(diǎn)圖。從圖2可以看出，主成分?jǐn)?shù)為5時(shí)建立判別模型的為最小，因此本試驗(yàn)PLS-DA模型建立的主成分?jǐn)?shù)選擇為5個(gè)。

圖2 PLS-DA模型RMSECV隨主成分?jǐn)?shù)的變化曲線

由于異常樣本會(huì)影響PLS-DA模型的穩(wěn)健性和預(yù)測(cè)精度[5]，本研究根據(jù)樣本在主成分得分散點(diǎn)圖上的分布，剔除6個(gè)樣品異常值之后建立模型。對(duì)剩余的118個(gè)樣品按照2∶1的比例分為2組，隨機(jī)選擇78個(gè)樣品作為校正集（摻雜牛奶和純牛奶樣品各39個(gè)），剩余的40個(gè)樣品作為預(yù)測(cè)集（摻雜牛奶和純牛奶樣品各20個(gè)），如表1所示。

表1 建立PLS-DA模型的校正集和預(yù)測(cè)集樣品分配

本試驗(yàn)在全波段（400～4 000 cm-1）范圍內(nèi)對(duì)校正集78個(gè)樣品數(shù)據(jù)建立摻雜土霉素牛奶的判別模型（圖3）。PLS-DA分析中，變量為類(lèi)別變量，對(duì)于兩類(lèi)判別，摻雜土霉素牛奶和純牛奶的變量值分別設(shè)定為 1 和 0。當(dāng)某一樣品預(yù)測(cè)值大于0.5 時(shí)，判定樣品為摻雜類(lèi)，而當(dāng)某一樣品預(yù)測(cè)值小于 0.5 時(shí)，判定樣品為未摻雜（純牛奶）類(lèi)[5]。圖3是摻雜土霉素牛奶的PLS-DA模型對(duì)校正集的內(nèi)部樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，對(duì)于土霉素?fù)诫s與否的判別正確率達(dá)到100%。

圖3 PLS-DA模型對(duì)校正集內(nèi)部樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果

為了驗(yàn)證所建立PLS-DA模型的判別能力和準(zhǔn)確性，用未參與建模的預(yù)測(cè)集40個(gè)樣品對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證。表 2 是模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)后的預(yù)測(cè)值及判別結(jié)果。結(jié)果表明，在全波段 （400～4 000 cm-1）范圍內(nèi)，40個(gè)樣品中共有4個(gè)樣品被誤判，其中2個(gè)純牛奶被誤判為摻雜土霉素牛奶， 2個(gè)摻雜牛奶被誤判為純牛奶。所建立模型的判別正確率為90.0%，預(yù)判結(jié)果良好。

表2 PLS-DA模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣品的判定結(jié)果

2.3 分波段分析

光譜范圍對(duì)建立模型的性能和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性有很大的影響，因此選擇合適的光譜波段建立模型非常重要。本文選取了2個(gè)不同的波數(shù)區(qū)間，即400～2 000 cm-1和2 000～4 000 cm-1分別建立了PLS-DA模型。表 3 給出了分波段和全波段區(qū)間下所建判別模型對(duì)校正集和預(yù)測(cè)集樣品的判別結(jié)果。由表3可知，2個(gè)分波段建模的主成分?jǐn)?shù)都為4，用全波段建模的主成分?jǐn)?shù)為5。利用校正集建立模型對(duì)牛奶是否摻雜土霉素進(jìn)行判別時(shí)，不論是分波段還是全波段，模型的判別準(zhǔn)確率都達(dá)到100%。波段為400～2 000 cm-1時(shí)，校正集建模相關(guān)系數(shù)較低（＝0.862），其余2個(gè)波段的建模相關(guān)系數(shù)均超過(guò)0.900。波段為2 000～4 000 cm-1時(shí)，模型的最低，為0.354 3 mg/L。通過(guò)預(yù)測(cè)集驗(yàn)證模型，3個(gè)不同建模波段的相關(guān)系數(shù)在0.995到0.997之間，表明所建模型的擬合效果良好。波段為2 000～4 000 cm-1時(shí)，模型的相關(guān)系數(shù)最高，也比其他2個(gè)波段要高。波段為400～2 000 cm-1時(shí)，模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣品摻雜與否的判別準(zhǔn)確率為87.5%，而其他2個(gè)波段所建模型對(duì)樣品摻雜與否的判別準(zhǔn)確率均為90.0%。總體分析，全波段和2 000～4 000 cm-1波段內(nèi)的PLS-DA建模效果要優(yōu)于400～2 000 cm-1波段。上述結(jié)果表明，不同波數(shù)區(qū)間建模對(duì)摻雜土霉素牛奶的預(yù)判模型有較大影響。

表3 基于分波段和全波段的PLS-DA模型的校正預(yù)測(cè)分析結(jié)果

3 結(jié)論

本研究利用中紅外光譜法對(duì)純牛奶中摻雜的土霉素（所摻土霉素質(zhì)量濃度為0.02～30 mg/L）進(jìn)行檢測(cè)。在全波段區(qū)間所建的PLS-DA模型對(duì)78個(gè)校正集樣品的判別正確率為 100.0%，對(duì)40個(gè)預(yù)測(cè)集未知樣品的判別正確率為90.0%。分別在分波段和全波段區(qū)間下建立模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣品進(jìn)行判別，建模相關(guān)系數(shù)在0.995到0.997之間，表明所建模型的擬合效果良好。其中全波段和2 000～4 000 cm-1波段內(nèi)所建模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣品的判別正確率均達(dá)到90.0%，優(yōu)于400～2 000 cm-1波段的判別正確率87.5%。研究表明，基于中紅外光譜的檢測(cè)方法可為無(wú)損檢測(cè)牛奶中是否摻雜土霉素等抗生素提供一種快捷簡(jiǎn)單的方法。盡管本研究只對(duì)抗生素?fù)诫s牛奶做了定性分析，但該方法可以初步判斷牛奶中是否含有抗生素，作為高效液相色譜法的補(bǔ)充，并提高檢測(cè)效率。

[1] 張俊升，李亞琳，王欽暉，等. 固相萃取-高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定牛奶中土霉素、金霉素的殘留量[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2006，25（5）：30-32.

[2] 汪善良，吳鵬，劉琳，等. 膠體金試紙條法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛奶中四環(huán)素類(lèi)藥物殘留比較[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2011，34（6）：268-271.

[3] Sivakesava S，Irudayaraj J. Rapid determination of tetracycline in milk by FT-MIR and FT-NIR spectroscopy[J]. Journal of Dairy Science，2002，85（3）：487-493.

[4] Wu N，Xu C S，Yang R J，et al. Detection of tetracycline in milk using NIR spectroscopy and partial least square[J].IOP Conference Series：Earth and Environmental Science，2018，113：012004.

[5] 楊仁杰，劉蓉，徐可欣. 基于近紅外光譜對(duì)牛奶中摻雜尿素的判別分析[J]. 食品科學(xué)，2012，33（16）：120-123.

[6] 廖彩淇，孫長(zhǎng)虹，楊瀟，等. 基于近紅外光譜紅茶中胭脂紅色素的判別[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，25（1）：72-75.

責(zé)任編輯：楊霞

Feasibility of rapid detection of oxytetracycline in milk by mid-infrared spectroscopy

XU Chen-shan, WU NanCorresponding Author, HAI Xia, WANG Jun, TIAN Jia, LIU Xiang-meng, BAO Zhen-bo, PENG Jin-xing

（College of Engineering and Technology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

The method for rapid detection of oxytetracycline residues in milk was established by combining mid-infrared （MIR） spectroscopy with partial least squares discriminant analysis（PLS-DA）. Firstly, 62 pure milk samples and 62 milk samples adulterated with different concentrations of oxytetracycline（0.02-30.00 mg/L）were prepared respectively. The MIR spectra of all samples were collected in the range of 400-4 000 cm-1. After the pretreatment of original spectral data, the PLS-DA models were established in the full band and sub band ranges, respectively. The results show that different wave-number ranges had a great influence on the prediction model of milk adulterated with oxytetracycline. The classification accuracies of the constructed PLS-DA models were 100% for calibration set in the full band and sub band ranges, and the correlation coefficients of models were between 0.995 and 0.997 for prediction set, which shows that the models had a good fitting effect. The classification accuracies of constructed models in the full band and in the range of 2 000-4 000 cm-1were 90.0% for prediction set.

milk; antibiotics; mid-infrared spectroscopy; partial least squares discriminant analysis

1008-5394（2018）03-0070-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.015

0657.33

A

2018-06-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21607114，41771357）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810061206）

徐琛善（1996－），男，本科在讀，主要從事環(huán)境與新能源方面的研究。E-mail：1209148248@qq.com。

吳楠（1984－），女，講師，博士，主要從事環(huán)境污染物方面的研究。E-mail：nwu@tjau.edu.cn。