李丹　杜德兵　袁容靜　王德成

[摘要] 目的 利用T-SPOT.TB測(cè)定、結(jié)核菌素試驗(yàn)方法（PPD法）及結(jié)核蛋白芯片法進(jìn)行兒童結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)診斷比較，以評(píng)價(jià)各種不同方法在兒童肺結(jié)核診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法 回顧性分析2015～2017年宜昌市第三人民醫(yī)院收治的疑似肺結(jié)核患兒108例，其中確診肺結(jié)核患兒57例，非結(jié)核患兒51例，用上述3種方法分別檢測(cè)108例患兒，統(tǒng)計(jì)分析三種方法在診斷兒童結(jié)核病的靈敏度、特異度，并比較T-SPOT.TB與PPD法及結(jié)核蛋白芯片法診斷兒童肺結(jié)核的準(zhǔn)確度。 結(jié)果 T-SPOT.TB測(cè)定法、PPD法及結(jié)核蛋白芯片法檢測(cè)兒童肺結(jié)核的靈敏度分別為87.72%、56.14%和52.63%；特異度分別為90.19%、66.67%和82.35%。 結(jié)論 T-SPOT.TB測(cè)定與PPD法及結(jié)核蛋白芯片法比較，具有快速、敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是臨床兒童結(jié)核病快速診斷的有效檢測(cè)方法。

[關(guān)鍵詞] T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；PPD皮試；基因芯片；兒童結(jié)核??；檢測(cè)方法

[中圖分類號(hào)] R529.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）16-0019-04

[Abstract] Objective To compare the application of T-SPOT.TB determination， tuberculin test method（PPD method） and tuberculosis protein chip method for the detection and diagnosis of mycobacterium tuberculosis in children， so as to evaluate the clinical application value of different methods in the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children. Methods 108 children patients with suspected tuberculosis who were admitted to Yichang Third Peoples Hospital from 2015 to 2017 were retrospectively analyzed. Of these， 57 children patients were diagnosed as pulmonary tuberculosis and 51 were non-tuberculosis. The above three methods were used to detect 108 cases of children. The sensitivity and specificity of the three methods in the diagnosis of pediatric tuberculosis were statistically analyzed， and the T-SPOT.TB， PPD methods and tuberculosis protein chip method in the diagnosis of pediatric pulmonary tuberculosis were compared. Results The sensitivity of T-SPOT.TB determination method， PPD method and tuberculosis protein chip method in the detection of pulmonary tuberculosis in children were 87.72%， 56.14% and 52.63% respectively； the specificity was 90.19%， 66.67% and 82.35% respectively. Conclusion Compared with PPD method and tuberculosis protein chip method， T-SPOT.TB determination method has the advantages of rapidity， high sensitivity and strong specificity. It is an effective clinical detection method for rapid diagnosis of tuberculosis in children.

[Key words] T-cell spot test； PPD skin test； Gene chip； Tuberculosis in children； Test method

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的結(jié)核病2014年度報(bào)告提示，現(xiàn)在全球兒童結(jié)核病患兒有增多趨勢(shì)，形勢(shì)較嚴(yán)峻，不容樂(lè)觀。近年來(lái)我國(guó)兒童肺結(jié)核病有明顯上升趨勢(shì)，由于目前我國(guó)對(duì)兒童肺結(jié)核病的特點(diǎn)及早期診療認(rèn)知不足，且診療手段有限，重癥兒童肺結(jié)核明顯增加[1-2]。因此早期診斷且及時(shí)治療兒童結(jié)核病是控制的關(guān)鍵。但是目前兒童肺結(jié)核早期診斷困難，漏診率和誤診率高。為了讓兒童肺結(jié)核病得到快速診斷，本文通過(guò)對(duì)兒童肺結(jié)核患者進(jìn)行血清T-SPOT.TB測(cè)定、PPD 皮試及結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)，觀察其對(duì)兒童肺結(jié)核的診斷價(jià)值，評(píng)價(jià)其臨床診斷的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取我院2015 年1 月～2017年12月肺結(jié)核或疑似肺結(jié)核患兒108 例，其中患兒的診斷、治療均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組《兒童肺結(jié)核的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方案》[3]并隨訪 6 個(gè)月；出院時(shí)最終診斷與入選時(shí)診斷相符。明確診斷的肺結(jié)核患兒57 例，其中男35 例，女22例，年齡1～14歲，平均9.5歲。其中非肺結(jié)核患兒51例，男33 例，女18例，年齡1～14歲，平均9.8歲。將51例非肺結(jié)核患兒作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并自身免疫系統(tǒng)病變；②合并代謝系統(tǒng)病變者及其他病變者；③有抗結(jié)核藥物使用史者；④有免疫類藥物使用史者；兩組研究對(duì)象年齡、性別比例及身體狀況比較差異均無(wú)顯著性（P>0.05），具有可比性。抽取入選者行卡介苗—純蛋白衍化物（BCG-PPD）皮試檢測(cè)。同時(shí)抽取空腹血液5 mL，血清標(biāo)本應(yīng)用血T-SPOT.TB檢測(cè)和血結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)。該研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試患兒均已由兒童監(jiān)護(hù)人簽屬知情同意書(shū)。入院后詳細(xì)詢問(wèn)病史、采集患兒卡介苗接種史、既往患兒結(jié)核患者密切接觸史、進(jìn)行體格檢查、影像學(xué)檢查、免疫學(xué)及分子生物學(xué)、痰涂片找結(jié)核菌、痰培養(yǎng)結(jié)核菌等檢查。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 T-SPOT.TB檢測(cè) 采集受試患兒外周靜脈血5 mL用肝素鈉抗凝，使用試劑盒從外周血分離出單個(gè)核細(xì)胞，參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，并置于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中孵育16～20 h，顯色洗板后對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照孔，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[4-5]：陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為 0～5 個(gè)，CFP-10 和ESAT-6抗原檢測(cè)孔任一孔計(jì)數(shù)-陰性孔計(jì)數(shù)≥6判為陽(yáng)性；如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性孔斑點(diǎn)數(shù)判為陽(yáng)性。

1.2.2 結(jié)核抗體蛋白檢測(cè)芯片的檢測(cè) 應(yīng)用蛋白芯片法檢測(cè)所有血清標(biāo)本，試劑盒、蛋白芯片閱讀儀等檢測(cè)儀器均由南京大淵生物技術(shù)工程有限公司提供，同一名檢驗(yàn)人員按照說(shuō)明書(shū)和相關(guān)規(guī)定在無(wú)菌條件下進(jìn)行所有操作，完成后將芯片放入芯片識(shí)別儀，根據(jù)生物芯片檢測(cè)軟件按程序操作，不同抗原點(diǎn)陣的灰度值進(jìn)行分析。該抗體檢測(cè)蛋白芯片試劑盒采用基因工程表達(dá)的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）、結(jié)核菌重組蛋白抗原16 kD和38 kD蛋白檢測(cè)待檢血清中的抗體，若其中任何一種抗體陽(yáng)性，則判斷該病例結(jié)核分枝桿菌抗體陽(yáng)性。若三種抗體檢測(cè)均為陰性，則結(jié)果可判定為陰性[6]。

1.2.3 結(jié)核菌素純蛋白衍化物測(cè)定 于患兒前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射 TB.PPD 0.1 mol·L-1（5 U），72 h后觀察注射部位的反應(yīng)情況，并測(cè)量硬結(jié)直徑（㎜）。PPD皮試結(jié)果判斷：硬結(jié)直徑（mm）<5 mm（-），≥5 mm（+），≥10～19 mm（++），≥20 mm或局部出現(xiàn)水泡、淋巴管炎、壞死潰破等為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

以臨床最終診斷結(jié)果作為金指標(biāo)，敏感性、特異性按下列公式計(jì)算：敏感性=真陽(yáng)性數(shù)/（真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù)），特異性=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù)）。評(píng)價(jià)各個(gè)試驗(yàn)方法的靈敏度、特異度，并進(jìn)行兩兩比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確診或疑似肺結(jié)核患兒的檢測(cè)結(jié)果

臨床確診為兒童結(jié)核病的57例中，T-SPOT.TB法陽(yáng)性率87.72%，結(jié)核蛋白芯片法陽(yáng)性率56.14%，PPD 法陽(yáng)性率52.63%，臨床確診為非結(jié)核性疾病的51例中，T-SPOT.TB法陽(yáng)性率9.81%，結(jié)核蛋白芯片法陽(yáng)性率17.65%，PPD法陽(yáng)性率33.33%，見(jiàn)表1。

2.2 T-SPOT.TB檢測(cè)與PPD試驗(yàn)靈敏度、特異度比較

108例入選患兒中，根據(jù)結(jié)果可計(jì)算出T-SPOT.TB檢測(cè)的靈敏度為87.72%，特異度為90.19%；可計(jì)算出PPD試驗(yàn)的靈敏度為56.14%，特異度為66.67%。見(jiàn)表2。T-SPOT.TB檢測(cè)診斷兒童結(jié)核病的靈敏度（87.72%）顯著高于PPD試驗(yàn)的靈敏度（56.14%）（P<0.05）；特異度（90.19%）顯著高于PPD試驗(yàn)的特異度（66.67%）（P<0.05）。

2.3 T-SPOT.TB檢測(cè)與結(jié)核蛋白芯片靈敏度、特異度比較

108例入選患兒中，根據(jù)結(jié)果可計(jì)算出T-SPOT.TB檢測(cè)的靈敏度為87.72%，特異度為90.19%；可計(jì)算出結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)的靈敏度為52.63%，特異度為82.35%。見(jiàn)表3。T-SPOT.TB檢測(cè)診斷兒童結(jié)核病的靈敏度（87.72%）顯著高于結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)的靈敏度（52.63%）（P<0.05）；兩種方法的特異度經(jīng)χ2檢驗(yàn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

2.4 聯(lián)合試驗(yàn)

當(dāng)T-SPOT.TB與PPD試驗(yàn)、結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)聯(lián)合使用時(shí)，兒童結(jié)核病組57例中T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性或結(jié)核蛋白芯片陽(yáng)性或PPD試驗(yàn)陽(yáng)性例數(shù)共53例，靈敏度診斷率達(dá)到92.98%（53/57），提示為了需要達(dá)到更高的診斷靈敏度時(shí)，臨床上可將三種診斷試驗(yàn)聯(lián)合使用，診斷效果更佳。

3 討論

兒童肺結(jié)核是一個(gè)特殊的群體，其感染后患病率高，病情嚴(yán)重，預(yù)后差。兒童肺結(jié)核臨床癥狀不典型，小兒結(jié)核無(wú)明顯自覺(jué)癥狀，又不易對(duì)癥狀清楚準(zhǔn)確地描述，很難與其他兒童肺部感染性疾病區(qū)別；肺結(jié)核特別是肺外結(jié)核的標(biāo)本采集困難。結(jié)核病確診手段依然是細(xì)菌學(xué)方法。但由于結(jié)核菌的遺傳特性，使常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查方法存在取材困難、靈敏度低、操作復(fù)雜，且結(jié)核培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，病原學(xué)診斷因此受限等缺點(diǎn)，使臨床診斷小兒結(jié)核十分困難。目前，結(jié)核病由于其具有極強(qiáng)的傳染性，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療顯得尤為重要。0～14 歲兒童由于其免疫力較低，初次感染結(jié)核分枝桿菌后就有可能發(fā)展成結(jié)核病，如未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)并診斷極易發(fā)展成重癥肺結(jié)核和肺外結(jié)核，晚期可引起嚴(yán)重的后遺癥。如何早期診斷小兒結(jié)核是臨床共同關(guān)注的問(wèn)題[7-8]。PPD 試驗(yàn)雖然具有時(shí)間短、簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜的優(yōu)點(diǎn)，但由于受重癥感染及患兒免疫力影響，在嚴(yán)重播散性結(jié)核病和免疫抑制兒童患兒中常表現(xiàn)為假陰性，且PPD檢測(cè)不易排除卡介苗接種（BCG）與非結(jié)核分枝桿菌（NTM）感染，對(duì)檢測(cè)的靈敏度、特異度影響較大，常導(dǎo)致誤診、漏診。本研究顯示結(jié)核病患兒PPD陽(yáng)性率為56.14%，此受我國(guó)實(shí)行普遍接種卡介苗的影響，假陰性率高達(dá)33.33%，與小兒免疫力低有關(guān)，給臨床診斷兒童肺結(jié)核帶來(lái)很大的困惑。

結(jié)核蛋白芯片系統(tǒng)是以微孔濾膜為載體，利用微陣列技術(shù)將純化的結(jié)核菌脂阿拉伯甘露糖（LAM）、蛋白38 kD和16 kD等三種抗原固相于同一膜片上，并利用微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝集作用，使抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，再以免疫金作為標(biāo)記物而直接在膜上顯色，對(duì)其灰度值進(jìn)行分析。LAM是分枝桿菌屬細(xì)胞壁的重要組成部分，屬特異性抗原，具有較強(qiáng)的免疫原性，其檢測(cè)的靈敏度較高，但除結(jié)核分枝桿菌外，其他分枝桿菌也有LAM成分，因此其特異性相對(duì)較低。結(jié)核分枝桿菌38 kD 抗原與16 kD抗原是結(jié)核分枝桿菌所特有的抗原，與其他分枝桿菌和非結(jié)核分支桿菌不存在交叉反應(yīng)，其診斷的特異性較高[9]。結(jié)核蛋白芯片法可分別檢測(cè)結(jié)核菌的特異性細(xì)胞壁脂多糖 LAM 抗體、38 kD 抗體和16 kD 抗體，以便能快速診斷患者結(jié)核菌感染情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)結(jié)核病患者的特異度為82.35%，靈敏度為52.63%，但診斷的靈敏度不夠高，不能滿足臨床診斷需要。

T-SPOT.TB是近幾年發(fā)展的一種快速準(zhǔn)確新型免疫性的診斷結(jié)核的方法，具有取材方便、快速、靈敏度及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家均已將T-SPOT.TB試驗(yàn)列入結(jié)核病診療指南，成為替代診斷結(jié)核病的主要方法[10-11]。其原理是以結(jié)核菌特異性抗原ESAT-6、CFP-10為刺激原，刺激患者外周血單核細(xì)胞中活化的T細(xì)胞，使其釋放 γ-干擾素，可以對(duì)能有效釋放 γ-干擾素的 T 細(xì)胞進(jìn)行定量，從而進(jìn)行診斷機(jī)體是否對(duì)活動(dòng)性結(jié)核感染。且其不受大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌和卡介苗的影響，且該檢驗(yàn)24 h即可出結(jié)果，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確，判斷標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單明確。國(guó)內(nèi)研究表明T-SPOT.TB試驗(yàn)在疑似結(jié)核病患者、活動(dòng)性肺結(jié)核及肺外結(jié)核及診斷中均具有較好的臨床診斷價(jià)值[12-14]，也為兒童肺結(jié)核的高效診斷提供了新的思維方式。本研究表明，T-SPOT.TB診斷兒童肺結(jié)核靈敏度87.72%，特異度90.19%，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果比較一致[15-16]，顯著高于PPD試驗(yàn)靈敏度及特異度（P<0.05），提示T-SPOT.TB檢測(cè)診斷兒童肺結(jié)核病的顯著優(yōu)勢(shì)在于靈敏度及特異度均較高，且不受BCG接種大多數(shù)和非結(jié)核分枝桿菌影響，診斷價(jià)值較高。本實(shí)驗(yàn)血清T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)兒童肺結(jié)核患者的靈敏度與結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)相比，特異度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究結(jié)果表明，與結(jié)核蛋白芯片法及PPD 法比較，T-SPOT.TB法診斷兒童結(jié)核病，具有快速、敏感性較高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是輔助診斷兒童結(jié)核病的重要依據(jù)，具有一定的參考價(jià)值。

兒童肺結(jié)核早期診斷困難，晚期易引起嚴(yán)重的并發(fā)癥及后遺癥，因此，早期診斷或鑒別診斷意義非常重要。為了更好提高兒童結(jié)核病的診斷靈敏度，將以上三種診斷試驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用是更好的選擇。

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（收稿日期：2018-02-08）