李建華 陳莉莉 唐小萬 章 展 黃 輝 楊 巧

結(jié)直腸癌（CRC）是發(fā)生在結(jié)直腸部位的常見消化道惡性腫瘤之一［1］。由于早期CRC癥狀不明顯，不易引起重視，20%～40%CRC患者就診時腫瘤已發(fā)展至進展期，且多數(shù)已錯過手術(shù)最佳時機，因此化療成為臨床上治療進展期CRC主要方法之一［2］。5-氟尿嘧啶、亞葉酸鈣聯(lián)合伊立替康（FOLFIRI）方案是目前治療進展期CRC標(biāo)準(zhǔn)化方案之一，然而伊立替康（CPT-11）會導(dǎo)致患者中性粒細胞減少和遲發(fā)性腹瀉等毒副反應(yīng)，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致死亡［3］。因此，探究影響CPT-11療效和毒性的因素可有效提高其有效性和安全性。研究表明，尿苷二磷酸葡萄醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1（UGT1A1）是調(diào)控CPT-11代謝的關(guān)鍵酶，其基因多態(tài)性與CPT-11的療效和毒副反應(yīng)有著密切關(guān)系［4］。本研究通過檢測進展期CRC患者UGT1A1基因型，并分析CPT-11對不同基因型患者的療效和毒副反應(yīng)，旨在探討UGT1A1基因多態(tài)性與CPT-11治療進展期CRC的療效及毒副反應(yīng)的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2015年10月至2017年1月在本院診治的進展期CRC患者149例為觀察對象，所有患者均采用5-氟尿嘧啶、亞葉酸鈣聯(lián)合伊立替康（FOLFIRI）方案進行治療，治療周期最多為6個周期。其中男115例，女34例，均為漢族；年齡41～82歲，平均（60.26±14.85）歲；病理分化高分化者58例，中低分化者91例；結(jié)腸癌84例，直腸癌65例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理檢驗和/或CT檢查確診為進展期CRC患者。（2）首次進行CPT-11治療者。（3）經(jīng)檢測UGT1A1基因型確定者。（4）1個月內(nèi)未接受手術(shù)或化療患者。（5）預(yù)期生存時間＞3個月患者。（6）知悉本研究并簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）排除其他類型惡性腫瘤患者。（2）排除有心腦血管疾病、肝腎功能不全、造血功能缺陷等基礎(chǔ)性疾病患者。（3）排除對相關(guān)藥物過敏患者。（4）排除曾接受過CPT-11治療患者。（5）排除伴嚴(yán)重感染患者。（6）排除臨床資料保存不完整患者。

1.2 主要試劑 Taq DNA Polymerase（Mg2+ free），購自諾唯贊生物公司；PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒，購自上海生工公司；DNA提取試劑盒，購自天根公司；普通光學(xué)顯微鏡，購自奧林巴斯公司；核酸分析儀、PCR擴增儀、核酸電泳儀、凝膠成像分析儀，購自伯樂公司。

1.3 方法 （1）基因組DNA的提?。翰捎肈NA提取試劑盒抽提各受試者的全血基因組DNA，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。采用核酸分析儀檢測其純度和濃度，經(jīng)檢測本研究所得DNA OD260/280為1.8～2.0，可用于后續(xù)試驗。將DNA稀釋后分裝，置于-20℃保存。（2）UGT1A1基因多態(tài)性的檢測：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對UGT1A1基因進行擴增。引物見表1。PCR反應(yīng)體系共50μl，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性，5min；94℃變性，30s；56℃退火，30s；72℃延伸，60s；35個循環(huán)；72℃延伸，7min；40個循環(huán)。電泳后，將PCR產(chǎn)物送至上海生工公司進行雙向測序。采用序列分析軟件對測序結(jié)果進行分析，確定各患者基因分型。（3）療效和毒副反應(yīng)評價：療效評價：按照實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）1.1版進行評價［5］，每兩周期進行一次療效評價，分為疾病進展（PD）、疾病穩(wěn)定（SD）、部分緩解（PR）、完全緩解（CR）。無進展生存時間（PFS）指受試者進入試驗至腫瘤發(fā)生惡化或死亡的時間長度。毒副反應(yīng)評價：觀察受試者在治療期間發(fā)生嘔吐、腹瀉、中性粒細胞減少等不良反應(yīng)的情況，按照美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）提出的標(biāo)準(zhǔn)對毒副反應(yīng)進行評價和分級［5］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸分析UGT1A1基因多態(tài)性與藥物毒副反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險，以比值比（OR）和95%可信區(qū)間（95%CI）表示；采用Kaplan-Meier方法進行生存分析，采用Logrank檢驗比較不同基因型患者無進展生存時間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UGT1A1基因多態(tài)性 UGT1A1*28位點檢測到三種基因型：野生型純合子TA6/6、突變型雜合子TA6/7和突變型純合子TA7/7，其中野生型TA6/6患者106例（71.14%）、突變型TA6/7 患者41例（27.52%）、突變型TA7/7患者2例（1.34%）；UGT1A1*6位點檢測到兩種基因型：野生型純合子GG和突變型雜合子GA，其中野生型GG患者121例（81.21%）、突變型GA患 者 28例（18.79%）。UGT1A1*28和 UGT1A1*6位點基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗（P=0.846，P=0.753）。

2.2 UGT1A1基因多態(tài)性與藥物毒副反應(yīng)的關(guān)系 見表1。

表1 UGT1A1基因多態(tài)性與藥物毒副反應(yīng)的關(guān)系［n（%）］

2.3 藥物毒副反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險的Logistic回歸分析 Logistic回歸分析表明，在調(diào)整年齡、性別、腫瘤分化程度、癌癥類型后，UGT1A1*28基因突變是3～4級腹瀉、3～4級中性粒細胞減少發(fā)生的 危 險 因 素（OR=2.18，95%CI為 1.99～2.39；OR=3.18，95%CI為 2.04～4.96）， 差 異 均 有 統(tǒng) 計學(xué)意義（P＜0.05）；UGT1A1*6突變是 3～4級中性粒細胞減少發(fā)生的危險因素（OR=1.68，95%CI為1.03～2.74，P＜0.05）。

2.4 UGT1A1基因多態(tài)性與藥物療效的關(guān)系 見表2。

表2 UGT1A1基因多態(tài)性與藥物療效的關(guān)系［n（%）］

2.5 CRC患者無進展生存時間與UGT1A1基因多態(tài)性之間的關(guān)系 UGT1A1*28突變型患者和野生型患者中位腫瘤無進展生存時間分別為8.2個月和9.4個月，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；UGT1A1*6突變型患者和野生型患者中位腫瘤無進展生存時間分別為9.3個月和10.1個月，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

CPT-11是一種喜樹堿衍生物，具有抑制細胞分裂的生物學(xué)功能。CPT-11抗腫瘤的藥效主要依賴于肝臟中羧酸酯酶（CEs）實現(xiàn)，CEs將其催化轉(zhuǎn)化成有活性的7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38），通過抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的活性，有效抑制腫瘤細胞DNA損傷修復(fù)，抑制基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞死亡。隨后在腸道中活性的SN-38可造成腸黏膜損傷，導(dǎo)致腹瀉發(fā)生；但腸道內(nèi)UGT1A1也可將SN-38轉(zhuǎn)化為無活性的SN-38G形式，從而阻止腹瀉的發(fā)生。因此，UGT1A1在這一系列反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，是腹瀉是否發(fā)生的關(guān)鍵。

UGT1基因定位于2號染色體，存在多種基因突變，其中研究最多的是位于啟動子區(qū)第28位點的TATA盒區(qū)域的突變，TA重復(fù)數(shù)目差異是UGT1A1基因多態(tài)性的一個表現(xiàn)，TA重復(fù)序列的增加或減少會影響UGT1A1蛋白表達，影響其生物學(xué)功能。UGT1A1*28基因多態(tài)性在不同人群中存在一定差異，本研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1*28野生型純合子TA6/6、突變型雜合子TA6/7、突變型純合子TA7/7基因型比例分別為71.14%、27.52%、1.34%，比非洲人群出現(xiàn)的頻率略低，與之前報道的亞洲人群出現(xiàn)的頻率基本一致［6］。UGT1A1*6是僅在亞洲人群中發(fā)現(xiàn)的一種基因變異體。UGT1A1*6位點檢測到野生型純合子GG和突變型雜合子GA兩種基因型，基因型比例分別為81.21%、18.79%，未檢測到突變型純合子AA，可能由于樣本量不足，將擴大樣本量進行進一步研究。

CPT-11對患者的毒副作用主要表現(xiàn)為中性粒細胞減少和遲發(fā)性腹瀉。張君孝等［7］研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1*28位點突變型患者發(fā)生＞3級血小板減少的風(fēng)險增加，UGT1A1*6位點突變型患者發(fā)生＞3級腹瀉的風(fēng)險增加。本研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1*28突變型患者3～4級腹瀉和3～4級中性粒細胞減少發(fā)生率均明顯高于野生型患者，3～4級白細胞減少發(fā)生率未見明顯差異；UGT1A1*6突變型患者3～4中性粒細胞減少發(fā)生率明顯高于野生型患者，3～4級腹瀉和3～4級白細胞減少發(fā)生率均未見明顯差異。Logistic回歸分析表明，在調(diào)整年齡、性別、腫瘤分化程度、癌癥類型后，UGT1A1*28突變型患者發(fā)生3～4級腹瀉和中性粒細胞減少的風(fēng)險顯著高于野生型患者；UGT1A1*6突變型患者發(fā)生中性粒細胞減少的風(fēng)險顯著高于野生型患者。提示在應(yīng)用CPT-11化療的CRC患者中，UGT1A1*28突變可增加＞3級腹瀉和＞3級中性粒細胞減少的發(fā)生風(fēng)險，但不增加＞3級白細胞減少的發(fā)生風(fēng)險；UGT1A1*6突變可增加3級以上中性粒細胞減少的發(fā)生風(fēng)險，但不增加＞3級腹瀉和＞3級白細胞減少的發(fā)生風(fēng)險。作者推測對CRC患者進行UGT1A1基因型分析，可有效預(yù)測FOLFIRI對患者的毒副作用，為合理使用CPT-11提供一定理論依據(jù)，從而為CRC患者提供更安全的個體化治療策略。

CPT-11能明顯提高惡性腫瘤患者的無進展生存期和總生存期，目前已廣泛應(yīng)用于胃癌、子宮癌、肺細胞癌等腫瘤的臨床治療。含有CPT-11的FOLFIRI方案已成為治療轉(zhuǎn)移性CRC的一、二線治療方案。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UUGT1A1*28和UUGT1A1*6各基因型患者的療效無明顯差異，且UGT1A1*28、UGT1A1*6突變型患者和野生型患者中位腫瘤無進展生存時間比較均無明顯差異。提示UGT1A1基因多態(tài)性與CPT-11治療CRC的療效無關(guān)。

綜上所述，UGT1A1*28/*6位點多態(tài)性可有效預(yù)測進展期CRC患者CPT-11所致＞3級腹瀉和＞3級中性粒細胞減少的發(fā)生率，對CRC患者進行UGT1A1基因型分析，可有效預(yù)測FOLFIRI方案對患者的毒副作用。然而，本研究只是對漢族CRC人群的一個研究，對其它種族種群可能不存在普適性，因此需要結(jié)合其他種群的相關(guān)研究，進行綜合評估，在今后的研究中將豐富樣本類型進行深入研究。