李玉兵 江少波 任小剛 求旦旦

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的4.6%，大多數(shù)膀胱癌為移行細胞癌（transitional cell carcinoma，TCC），5年內(nèi)復(fù)發(fā)率為50%～70%，并有10%～30%進展為肌層浸潤性膀胱癌，50%～80%的膀胱癌會發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲，且轉(zhuǎn)移和侵襲是導(dǎo)致膀胱癌治療失敗的主要原因。Med-19基因在人體內(nèi)已被定義為腫瘤相關(guān)基因，在胃癌、肺癌、骨肉瘤、腦星型細胞瘤等許多惡性腫瘤組織中都存在高表達，而其來源的正常組織或良性病變則低表達或不表達。目前有研究發(fā)現(xiàn)，在高分級、肌層浸潤性腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)腫瘤及腫瘤較大情況下，Med-19基因表達水平均明顯高于正常組及低級別組，提示Med-19基因的表達異?？赡軈⑴c膀胱黏膜的惡性轉(zhuǎn)化過程，然而抑制Med-19基因表達是否能夠影響膀胱癌細胞的遷移及侵襲能力尚無研究。本實驗采用人膀胱癌T24細胞株為對象，采用小RNA干擾的方法沉默Med-19基因表達，并觀察T24細胞遷移及侵襲功能的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人膀胱癌細胞株T24（中國科學(xué)院上海細胞生物研究所）；胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基和脂質(zhì)體Lipofectanine2000TM（Invitrogen公司）；鼠抗人非特異性mIgG、Med-19兔多抗（Santa-Cruz Biotechnology公司）；Transwell chamber（8μm孔徑）購于Costar公司。

1.2 pSilencer-Med-19-siRNA載體構(gòu)建 采用以往文獻報道，設(shè)計針對Med-19基因的特異siRNA（5'-GGTGAAGGAGAAGCTAAGT-3'），連接入pSilencer表達載體，酶切測序鑒定pSilence-Med-19-siRNA載體構(gòu)建成功，本部分實驗由上海吉凱基因技術(shù)有限公司完成。

1.3 細胞培養(yǎng)及T24細胞轉(zhuǎn)染 人膀胱癌T24細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，T24細胞以1×105個/孔的密度將細胞分種于6孔培養(yǎng)板，并置于37℃，5%CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，將pSilence-Med-19-siRNA轉(zhuǎn)染入T24細胞，轉(zhuǎn)染前細胞密度為60%～75%，濃度為60nmol/L，孵育72h。

1.4 半定量PCR 利用Trizol Reagent將各實驗組的T24細胞提取總RNA，紫外分光光度計準確定量。取3μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。Med-19上游引物：5'-TGACAGGCAGCACGAATC-3'，下游引物：5'-CAGGTCAGGCAGGAAGTTAC-3'，GAPDH 上游引物：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。PCR反應(yīng)條件為94℃變性4min后，按下列參數(shù)循環(huán)32次：94℃變性20s，57℃退火40s，72℃延伸40s。最后72℃孵育10 min。

1.5 Western Blot蛋白印跡分析 細胞轉(zhuǎn)染72h后，收集細胞，利用RIPA細胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，并調(diào)整待測樣本的蛋白質(zhì)含量。每孔加20μl的蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，將膜放入稀釋的一抗中，溫和振蕩3h后置4℃冰箱中過夜。再溫和振蕩（4℃）2h，回收一抗后在TBST中洗膜30min，中間更換TBST 2～3次，分別將膜置于稀釋的二抗中溫和振蕩lh，后在TBST中洗膜30min，中間換液3～4次。曝光、顯影及定影，用底片掃描儀掃描X線膠片，通過凝膠成像系統(tǒng)（Kodak digital science system dc-120）讀取目的電泳條帶的密度掃描值。

1.6 Transwell-侵襲試驗 采用改良Transwell的Boyden小室，取指數(shù)生長期T24細胞以1×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，孵育12h后分別轉(zhuǎn)染pSilencer-空載體和pSilencer-Med-19-siRNA載體，繼續(xù)培養(yǎng)24h后消化離心，調(diào)整細胞密度為4×105/ml，取0.2ml接種至已被Matrigel包被的Transwell小室，并將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，以血清濃度差作為趨化條件：小室內(nèi)為含5%滅活血清的培養(yǎng)基，下室為含20%滅活血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24h后用棉簽頭擦掉Matrigel膠，予甲醇固定，吉姆薩染色，取膜，封片，鏡檢。400倍光鏡下，計數(shù)每膜上下左右中5個隨機不同視野的穿膜細胞數(shù)，取均值，每組平行設(shè)3個小室。實驗重復(fù)3次。

1.7 Transwell-遷移試驗 Transwell小室表面不鋪Matrigel膠，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（s）表示，進行單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后Med-19基因的表達 利用Western Blotting、RT-PCR檢測Med-19表達水平的變化。如圖1所示：與空白對照組、spSilencer-空載體組對比，pSilencer-Med-19-siRNA載體組的Med-19蛋白、基因表達量均被明顯抑制，降低約83%（P＜0.05），以上結(jié)果均重復(fù)＞3次。

圖1 pSilencer-Med-19-siRNA顯著抑制Med-19蛋白、基因的表達水平

2.2 降低Med-19表達可抑制T24細胞的遷移能力 Transwell-遷移試驗顯示，在每高倍鏡視野下，空白對照組、spSilencer-空載體組的細胞數(shù)目顯著高于pSilencer-Med-19-siRNA載體組（P＜0.05）。見圖2。

2.3 降低Med-19表達可抑制T24細胞的侵襲能力 Transwell-侵襲試驗顯示，在每高倍鏡視野下，Control組、spSilencer-空載體組的細胞數(shù)目顯著高于pSilencer-Med-19-siRNA載體組（P＜0.05），提示降低Med-19表達可以明顯抑制膀胱癌T24細胞的侵襲能力。見圖3。

圖2 pSilencer-Med-19-siRNA對T24細胞遷移能力的影響

圖3 pSilencer-Med-19-siRNA對T24細胞侵襲能力的影響

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的4.6%，大多數(shù)膀胱癌為TCC，5年內(nèi)復(fù)發(fā)率為50%～70%，并有10%～30%進展為肌層浸潤性膀胱癌，50%～80%的膀胱癌會發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲，且轉(zhuǎn)移和侵襲是導(dǎo)致膀胱癌治療失敗的主要原因［1］。從腫瘤生物學(xué)角度來看，惡性腫瘤是一種全身性疾病，存在轉(zhuǎn)移及擴散的特征，因此，局部和整體相結(jié)合的綜合治療是腫瘤治療的重要原則［2］。近年來，分子靶向治療膀胱癌已成為臨床科研的熱點，眾多研究試圖尋找治療膀胱癌的特異性靶向分子，但收效甚微，其原因在于目前尚未找到從源頭上真正調(diào)控膀胱癌生物學(xué)活性的關(guān)鍵分子［3］。

Med-19基因為中介因子復(fù)合體（Med）的1個亞基，在人體內(nèi)Med-19基因已被定義為腫瘤相關(guān)基因，在胃癌、肺癌、骨肉瘤、腦星型細胞瘤等許多惡性腫瘤組織中都存在高表達，而其來源的正常組織或良性病變則低表達或不表達［4］，其機制可能通過影響原癌基因或者相關(guān)細胞因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的表達來發(fā)揮作用，目前有研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌組織中Med-19的表達陽性率顯著高于正常膀胱黏膜組織，結(jié)合膀胱癌臨床病理學(xué)特征資料進一步分析發(fā)現(xiàn)，在高分級、肌層浸潤性腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)腫瘤及腫瘤較大情況下，Med-19基因表達水平均明顯高于相對應(yīng)組別，提示Med-19基因的表達異?？赡軈⑴c膀胱黏膜的惡性轉(zhuǎn)化過程［5］。雙鏈小干擾RNA（siRNA）可以在多種類型的細胞中介導(dǎo)特異性的基因沉默作用，這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為深入研究單個基因的功能提供了重要的方法學(xué)基礎(chǔ)，從而得到了廣泛的應(yīng)用［6］。本研究通過構(gòu)建pSilencer-Med-19-siRNA載體，并轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細胞株。與轉(zhuǎn)染空載體的T24細胞相比，pSilencer-Med-19-siRNA載體轉(zhuǎn)染可顯著抑制T24細胞的遷移和侵襲速度，其機制可能與Med-19直接或間接參與和介導(dǎo)了多種信號途徑有關(guān)，具體機制需要進一步研究。本研究結(jié)果表明，通過特異性下調(diào)Med-19基因的表達水平可逆轉(zhuǎn)膀胱癌細胞的惡性表征。Med-19基因在惡性腫瘤生長、分化、侵襲等方面的表現(xiàn)，為人們從分子水平治療膀胱癌提供新的思維。