張 兵，張麗娜，韓鵬軍，黃 瑞，祁東利，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術教育部工程中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193）

中藥白術為菊科植物白術（Atractylodesmacrocephala Koidz.）的干燥根莖。中醫(yī)認為白術味苦、甘，性溫。歸脾、胃經(jīng)。具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎功效。用于脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動不安等癥[1]。近年來的研究表明白術具有抗炎、利尿、抗衰老、抑制腫瘤、促進胃腸運動、提高機體免疫力等作用[2-7]，同時對神經(jīng)系統(tǒng)與子宮平滑肌也有一定調(diào)節(jié)作用[8-9]。2015年版中國藥典中僅收錄了白術飲片，并未指明其藥材、飲片的含量測定項。本文研究建立了白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量測定方法，對來自4個產(chǎn)地的12批次白術飲片進行了上述成分的含量測定，測定了白術飲片的指紋圖譜，并對結果進行聚類分析，以期為白術的質(zhì)量標準研究提供依據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

島津LC-20A液相色譜儀（日本島津公司），安捷倫1200LC-DAD液相色譜儀（美國安捷倫公司），XP205型十萬分之一天平（METTLER TOLEDO），F(xiàn)124型萬分之一天平（天津億諾科學儀器有限公司），Q-300B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），Mill-QⅡ型超純水系統(tǒng)（Millipore公司），中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

白術內(nèi)酯Ⅰ（天津中新藥業(yè)，Lot.No.:W10-3-1，純度≥98.0%）；白術內(nèi)酯Ⅱ（天津中新藥業(yè)，Lot.No.:W13-4-9，純度≥98.0%）；白術內(nèi)酯Ⅲ（天津中新藥業(yè)，Lot.No.:W09-9-8，純度≥98.0%）；乙腈為色譜級（天津康科德試劑有限公司）；水為超純水；白術飲片來源見表1。

表1 白術產(chǎn)地與批次

2 方法與結果

2.1 白術飲片中白術內(nèi)酯含量測定

2.1.1 標準對照品儲備液制備 分別精密稱取白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對照品適量，加甲醇制成每1 mL含76.83、77.61、156.40μg的標準對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取樣品粉末（過5號篩）2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）30 min，取出，再稱質(zhì)量，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（5μm,250 mm×4.6 mm），流動相為乙腈-水=50∶50（v/v），流速 1.0 mL/min，柱溫 30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長 222 nm（白術內(nèi)酯 I、III）[10-11]與278 nm（白術內(nèi)酯 II）[10-14]。

2.1.4 線性關系考察 取各對照品溶液，用甲醇稀釋成系列濃度，按2.1.3中條件測定色譜峰面積，以標準品濃度（μg/mL）為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ回歸方程分別為：Y=44219X-1399.9（r2=0.9985），Y=57339X-1 035.3（r2=0.999 2），Y=27 654X-3 278.8（r2=0.996 9）；線性范圍分別為 0.015～0.768μg，0.016～0.776μg和0.031～1.594 μg。

2.1.5 精密度實驗 精密吸取安徽20150603批次白術飲片供試品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，測定色譜峰面積，結果白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RSD（n=6）分別為1.58%、2.28%和1.03%。數(shù)據(jù)表明本實驗精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗 精密吸取安徽20150603批次白術飲片供試品溶液 10 μL，于 0、2、4、8、12、24 h分別進樣分析，測定色譜峰面積，結果白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的 RSD（n=6）分別為 1.46%、3.81%和0.96%。表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復性實驗 精密稱取安徽20150603批次白術飲片粉末6份，每份2 g，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL進樣測定。結果白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RSD分別為2.61%、2.35%和3.50%。結果表明方法重復性良好。

表2 白術飲片中白術內(nèi)酯含量測定結果（%，n=2）

2.1.8 加樣回收實驗 取已知白術內(nèi)酯含量的樣品粉末6份，每份1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入濃度為76.83μg/mL的白術內(nèi)酯Ⅰ對照品溶液10 mL，濃度為77.61μg/mL的白術內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌啡芤? mL，加入濃度為78.20μg/mL的白術內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液各6 mL，按2.1.2項下方法制備供試溶液，精密吸取10μL進樣測定，計算回收率。結果白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均回收率分別為100.98%，95.35%和95.23%，RSD分別為0.78%，2.40%和4.46%。結果表明方法加樣回收率結果良好。

2.1.9 樣品測定結果 分別取4個產(chǎn)地12批次白術樣品粉末，每個樣品取2份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL進樣測定，樣品中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量結果見表2。

2.2 白術飲片指紋圖譜的建立與測定

2.2.1 標準對照品溶液和供試品溶液制備 見2.1項下內(nèi)容。

2.2.2 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（5μm,250 mm×4.6 mm），流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序為：0～15 min，45%～55%A；15～20 min，55%A；20～40 min，55%～61%A；40～51 min，61%～69%A；51～80 min，69%～100%A；80～87 min，100%A；流速 1.0 mL/min，進樣量 10μL，柱溫 25℃，檢測波長220 nm。

2.2.3 精密度實驗 取供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按2.2.2項下的色譜條件測定，以參比峰的保留時間和峰面積為參照，計算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD為0.04%～2.61%，相對峰面積的RSD為0.59%～6.91%，表明儀器穩(wěn)定，儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，在0、2、4、8、12、24、48 h按2.2.2項下的色譜條件測定6次。以參比峰的保留時間和峰面積為參照，計算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間RSD在0.003%～1.82%，相對峰面積的RSD在1.09%～7.58%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復性實驗 取6份供試品溶液，按2.2.2項下的色譜條件測定。以參比峰的保留時間和峰面積為參照，計算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD為0.00%～0.08%，相對峰面積的RSD為1.46%～6.28%，表明方法重復性好。

2.2.6 樣品的測定和指紋圖譜的建立 取標準對照品溶液和12批白術供試品溶液，分別進樣10μL，液相測定。將色譜數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”，7號峰峰面積最大且穩(wěn)定，故選擇作為參比峰（S），以A1圖譜為校正參照，時間窗寬度設為1.0 min，建立12批次白術飲片指紋圖譜疊加圖，見圖1，確定10個共有峰，得到白術飲片共有峰指紋圖譜（R），每批樣品與R比較，計算12批樣品的指紋圖譜相似度，其相似度在0.972～0.998之間，見表3。

圖1 白術飲片的指紋圖譜疊加圖和共有峰圖譜（R）

表3 12批白術指紋圖譜相似度

2.2.7 系統(tǒng)聚類分析 以12批白術飲片中的3種成分含量、10種共有成分的相對峰面積為變量，采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對樣品進行聚類分析。采用利差平方和法（Ward法），以歐氏距離平方作為樣品測度，聚類樹狀圖見圖2。

由系統(tǒng)聚類樹狀圖可以看出，12批白術飲片樣品被分為4類，與白術飲片產(chǎn)地具有較好的一致性，根據(jù)聚類分析的結果可大致判斷白術飲片的產(chǎn)地。

圖2 白術飲片聚類分析

3 討論

分析4個產(chǎn)地12批次白術飲片中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量結果，發(fā)現(xiàn)白術內(nèi)酯的單一成分含量和3個成分總含量的高低順序具有一致性，各產(chǎn)地飲片中白術內(nèi)酯含量由高至低依次為浙江、河北、湖南、安徽，而這可能與其產(chǎn)地、生長年限、環(huán)境、采收加工等因素有關。

在指紋圖譜相似度評價中，4個產(chǎn)地12批次白術飲片指紋圖譜與共有峰R圖譜的相似度在0.972～0.998之間。其中A8樣品（浙江20150701）的相似度最低（0.972），這可能是該樣品中白術內(nèi)酯總量最高所造成的。

在系統(tǒng)聚類分析中，A7～A9樣品被分為一類，表明該產(chǎn)地（浙江）白術飲片不同批次之間質(zhì)量均一性良好，這與其內(nèi)酯類含量在4個產(chǎn)地中最高的含量測定結果和最低的指紋圖譜相似度結果相一致。而A4與A5、A1與A3各被分至一類，表明這兩個產(chǎn)地（安徽、湖南）的白術飲片質(zhì)量較為均一。

高效液相色譜法含量測定結合指紋圖譜分析與系統(tǒng)聚類分析的評價方法，適用于中藥質(zhì)量控制與評價。在本實驗中，通過三者結合的方法，在一定程度上表征了不同產(chǎn)地不同批次白術飲片在化學成分方面的共性與差異，并大致區(qū)別出了白術飲片的產(chǎn)地，基于三者的綜合信息，可以為白術飲片質(zhì)量控制與評價提供參考。