袁 琨,沈昊陽(yáng),賈東芬,馮 達(dá)

(1.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 光學(xué)與電子科技學(xué)院,浙江 杭州 310018;2.杭州彩譜科技有限公司,浙江 杭州 310034;3.北京六角體科技發(fā)展有限公司,北京 101102)

大腸菌群因廣泛存在于溫血?jiǎng)游锏募S便中和自然界中而被國(guó)際公認(rèn)為檢測(cè)醫(yī)藥[1]、環(huán)境[2]及水體檢測(cè)[3-4]的安全性指示菌.目前多用濾膜法(MF)[5]和多管發(fā)酵法(MTF)進(jìn)行檢測(cè).其中,MF法是檢測(cè)大腸菌群的“金標(biāo)準(zhǔn)”[6].但是這兩種方法需要在觀察到陽(yáng)性結(jié)果后進(jìn)行驗(yàn)證測(cè)試,測(cè)量周期長(zhǎng),而且測(cè)量方法繁瑣.在食品安全快速檢測(cè)工作中,亟需一種快速檢測(cè)的方法[7-8].

酶底物法(Enzyme substrate technique)采用大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)分解ONPG(Ortho- nitrophenyl-β- D- galactopyranoside),使培養(yǎng)液在波長(zhǎng)366 nm紫外光下產(chǎn)生熒光的原理,來(lái)判斷水樣中是否含有大腸菌群[9].陳燦映等研究了大腸菌群快速檢測(cè)培養(yǎng)基,實(shí)現(xiàn)了培養(yǎng)18 h.即可對(duì)大腸菌群進(jìn)行檢測(cè)[10].生長(zhǎng)時(shí)間光譜法是利用分光光度法和酶底物法相結(jié)合的一種快速檢測(cè)方法.采用分光光度法直接測(cè)量,可以獲得更短的檢測(cè)時(shí)間.蔡盡忠等基于生長(zhǎng)時(shí)間光譜法[11]實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸菌群9 h即可得到檢測(cè)結(jié)果,測(cè)量數(shù)值與菌落形成數(shù)的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6.

本文針對(duì)微生物快速檢測(cè)的需求,基于生長(zhǎng)時(shí)間光譜法設(shè)計(jì)了大腸菌群快速檢測(cè)儀器.根據(jù)大腸菌群指數(shù)生長(zhǎng)期與大腸菌群濃度的關(guān)系來(lái)計(jì)算大腸菌群初始濃度.以O(shè)NPG(鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷)為底物,研究了初始大腸菌群濃度與可見(jiàn)光波段特定波長(zhǎng)處透過(guò)率測(cè)量值之間的關(guān)系,采用分光光度法對(duì)大腸菌群的生長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行檢測(cè).通過(guò)構(gòu)建基于雙積分球的測(cè)量光學(xué)結(jié)構(gòu),較低的平行樣測(cè)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,實(shí)現(xiàn)了更短測(cè)量時(shí)間.

1 生長(zhǎng)時(shí)間光譜法的原理

當(dāng)利用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)大腸菌群進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),大腸菌群的數(shù)目會(huì)隨著生長(zhǎng)時(shí)間的增加而改變.大腸菌群的繁殖過(guò)程主要分為幾個(gè)階段,接種初期大腸菌群生長(zhǎng)會(huì)進(jìn)入一個(gè)停滯期.停滯一段時(shí)間后,大腸菌群開始繁殖,進(jìn)入一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的時(shí)期.指數(shù)增長(zhǎng)到一定程度,大腸菌群的菌落數(shù)目會(huì)進(jìn)入一個(gè)穩(wěn)定的時(shí)期,這個(gè)穩(wěn)定期過(guò)后,大腸菌群由于自身的原因會(huì)進(jìn)入衰亡階段,如圖1.大腸菌群細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,這種酶分解ONPG使培養(yǎng)液呈黃色,所以溶液的顏色就成為了大腸菌群菌落形成數(shù)的指示標(biāo)志[12].通過(guò)分光光度法對(duì)特定波長(zhǎng)透過(guò)率的檢測(cè)就能準(zhǔn)確的指示大腸菌群的菌落數(shù)變化,大腸菌群的生長(zhǎng)時(shí)間與透過(guò)率的變化如圖2.

圖1 大腸菌群生長(zhǎng)時(shí)間曲線Figure 1 Total coliforms growth time curve

圖2 大腸菌群的生長(zhǎng)時(shí)間與透過(guò)率的關(guān)系Figure 2 Relationship between growth time and transmissibility of total coliforms

生長(zhǎng)時(shí)間光譜法就是利用大腸菌群繁殖過(guò)程中的指數(shù)增長(zhǎng)這一時(shí)期,大腸菌群到達(dá)穩(wěn)定菌落數(shù)的時(shí)間與大腸菌群的初始濃度有關(guān).由大腸菌群達(dá)到穩(wěn)定期所消耗的生長(zhǎng)時(shí)間和大腸菌群的初始濃度的特定關(guān)系進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)學(xué)計(jì)算求出大腸菌群的初始濃度.透過(guò)率到達(dá)某一個(gè)固定透過(guò)率Tt所需要的時(shí)間t與大腸菌群的初始濃度相關(guān).

在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,為了使檢測(cè)時(shí)間縮短,需要使得Tt盡可能高.即分光光度測(cè)量結(jié)果在大腸菌群數(shù)量比較少時(shí),透過(guò)率信號(hào)應(yīng)能穩(wěn)定體現(xiàn)菌群的菌落數(shù)量,需要保證多次測(cè)量的測(cè)量穩(wěn)定性.傳統(tǒng)的分光光度計(jì)多采用0/0測(cè)量幾何條件,且光束直徑較小.由于基于生長(zhǎng)時(shí)間光譜法的大腸菌群快速檢測(cè)中,在對(duì)大腸菌群進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),菌群是在比色皿中隨機(jī)位置出現(xiàn)的,菌群的位置和大小會(huì)造成分光光度計(jì)入射光線的散射,給測(cè)量穩(wěn)定性帶來(lái)較大影響,如圖3.所以,在儀器測(cè)量光路設(shè)計(jì)中,應(yīng)保證所有的透射光均應(yīng)被探測(cè)器檢測(cè)到,以增強(qiáng)測(cè)量的穩(wěn)定性.

圖3 分光光度法測(cè)量原理和散射現(xiàn)象Figure 3 Spectrophotometric measurement principle and scattering phenomenon

2 大腸菌群快速檢測(cè)儀器設(shè)計(jì)

2.1 儀器光路結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)

為了增強(qiáng)測(cè)量穩(wěn)定性,設(shè)計(jì)了基于雙積分球結(jié)構(gòu)的雙光路測(cè)量光學(xué)結(jié)構(gòu),如圖4.光路結(jié)構(gòu)由光源、兩個(gè)探測(cè)器和兩個(gè)積分球構(gòu)成.兩個(gè)積分球的內(nèi)表面均涂敷白色高反射漫反射涂料.光源發(fā)出來(lái)的光首先進(jìn)入積分球A中,光線經(jīng)過(guò)重復(fù)勻化后漫入射至比色皿,經(jīng)過(guò)在比色皿中傳輸后從比色皿后表面出射,出射光在積分球B中進(jìn)行勻化后,進(jìn)入傳感器.此外,為了保證測(cè)量結(jié)果不受光源波動(dòng)影響,另外一個(gè)傳感器B采用光纖對(duì)光源能量波動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),取I=I1/I1,作為最終結(jié)果.

本設(shè)計(jì)中采用LED作為光源,以硅光電池作為檢測(cè)元器件.從LED光源發(fā)出的可見(jiàn)光經(jīng)積分球的勻光后照射到樣品池中,樣品的透射光在經(jīng)過(guò)積分球勻光后會(huì)經(jīng)過(guò)特定波長(zhǎng)的濾光片,再由硅光電池收集透射光信號(hào).這種光路結(jié)構(gòu)保證了入射至比色皿表面的入射光是漫入射光,所有方向的出射光全部可以被傳感器采集.這樣就避免了由于大腸菌群在比色皿中分布不均勻?qū)y(cè)量產(chǎn)生的影響.

圖4 雙積分球光學(xué)測(cè)量結(jié)構(gòu)Figure 4 Double-integrated sphereoptical measurement structure

2.2 測(cè)量波長(zhǎng)選擇實(shí)驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸菌群菌株分離于生活污水,酶底物ONPG(鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷),ONPG培養(yǎng)基,瓊脂培養(yǎng)基和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基.

2.2.2 制備菌懸液

將大腸菌群接種于瓊脂培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)24 h,用接種環(huán)將菌體接種到0.9%生理鹽水制成菌懸液,用0.9%生理鹽水依次稀釋,制備一系列濃度為10、102、103、104、105、106、107cfu/mL的大腸菌群樣品溶液.

2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

將不同菌落數(shù)的大腸菌群樣品溶液接種到ONPG培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)下進(jìn)行測(cè)試,每隔1 min測(cè)試一次溶液透過(guò)率,測(cè)試時(shí)長(zhǎng)為5 h.使用波長(zhǎng)范圍為300～800 nm的分光光度計(jì),每間隔1 nm對(duì)樣品透過(guò)率進(jìn)行測(cè)量.以460 nm,515 nm,525 nm,595 nm,625 nm的測(cè)量結(jié)果為例,如圖5-9.

圖5 波長(zhǎng)460 nm下恒溫37 ℃時(shí)8種不同菌落形成數(shù)的大腸菌群透過(guò)率隨時(shí)間的變化曲線Figure 5 Curves of the transmissibility of coliforms in 8 different concentrations at a constant temperature of 37 ℃ at a wavelength of 460 nm over time

圖6 波長(zhǎng)515 nm下恒溫37 ℃時(shí)8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過(guò)率隨時(shí)間的變化曲線Figure 6 Curves of the transmissibility of coliforms in 8 different concentrations at a constant temperature of 37 ℃ at a wavelength of 515 nm over time

圖7 波長(zhǎng)525 nm下恒溫37 ℃時(shí)8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過(guò)率隨時(shí)間的變化曲線Figure 7 Curves of the transmissibility of coliforms in 8 different concentrations at a constant temperature of 37 ℃ at a wavelength of 525 nm over time

圖8 波長(zhǎng)595 nm下恒溫37 ℃時(shí)8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過(guò)率隨時(shí)間的變化曲線Figure 8 Curves of the transmissibility of coliforms in 8 different concentrations at a constant temperature of 37 ℃ at a wavelength of 595 nm over time

圖9 波長(zhǎng)625 nm下恒溫37 ℃時(shí)8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過(guò)率隨時(shí)間的變化曲線Figure 9 Curves of the transmissibility of coliforms in 8 different concentrations at a constant temperature of 37 ℃ at a wavelength of 625 nm over time

使用所有波長(zhǎng)測(cè)量都難以對(duì)10 cfu/mL、102cfu/mL的大腸菌群樣品溶液進(jìn)行分辨,本測(cè)量方案的最低檢出限應(yīng)為102cfu/mL.

若不考慮10 cfu/mL、102cfu/mL的大腸菌群樣品溶液檢測(cè)數(shù)據(jù),在波長(zhǎng)625 nm下恒溫37 ℃時(shí)8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過(guò)率隨時(shí)間的變化曲線中可以明顯看出,樣品菌落形成單位越大,透過(guò)率下降的越早,和理論分析相符.所以,可以采用波長(zhǎng)625 nm作為分光光度測(cè)量波長(zhǎng).

3 大腸菌群生長(zhǎng)時(shí)間模型的建立

基于生長(zhǎng)時(shí)間光譜法的原理,需要建立大腸菌群的生長(zhǎng)時(shí)間與大腸菌群的初始菌落數(shù)的數(shù)學(xué)模型.大腸菌群的生長(zhǎng)時(shí)間通過(guò)樣品透過(guò)率的變化進(jìn)行測(cè)量,采用樣品從實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的初始透過(guò)率降低至初始透過(guò)率的70%時(shí)所需時(shí)間作為生長(zhǎng)時(shí)間.

根據(jù)圖9所示的波長(zhǎng)625 nm下恒溫37 ℃時(shí)8種不同菌落形成單位的大腸菌群透過(guò)率隨時(shí)間的變化曲線,培養(yǎng)開始時(shí)的時(shí)刻為t0,同時(shí)記錄此時(shí)樣品透過(guò)率T0.開始每分鐘對(duì)樣品透過(guò)率進(jìn)行一次測(cè)量,當(dāng)測(cè)量透過(guò)率ΔT≤0.7×T0時(shí),此時(shí)刻為t,取Δt=t-t0.具體數(shù)據(jù)如表1.

表1 大腸菌群初始菌落數(shù)與生長(zhǎng)期時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系

生長(zhǎng)時(shí)間t與大腸菌群特定菌落數(shù)Ct的關(guān)系可以描述為

Ct=C0×e-kΔt.

(1)

式(1)中C0為大腸菌群初始菌落數(shù),Δt為指數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)長(zhǎng)即達(dá)到穩(wěn)定時(shí)期的時(shí)間t與開始指數(shù)生長(zhǎng)的時(shí)間t0的差值.

取對(duì)數(shù)表示關(guān)系式

lnC0=C0×e-kΔt.

(2)

對(duì)表1中的數(shù)據(jù)按照式(2)進(jìn)行擬合,即可得到確定的大腸菌群初始菌落數(shù)與生長(zhǎng)期時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系如式(3).從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn),對(duì)大腸菌群100 cfu/mL的檢測(cè),只需要276 min的生長(zhǎng)時(shí)間.

lnC0=17.68-0.048 37×Δt.

(3)

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

4.1 多次測(cè)量平行樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)試

制作102、103、104、105、106、107cfu/mL的大腸菌群樣品溶液共6組,每組10個(gè),通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定每組溶液,每組結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2.

表2 不同濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與濾膜法測(cè)量結(jié)果的比對(duì)

選取20個(gè)水樣,其中地表水10個(gè),地下水10個(gè),對(duì)每個(gè)水樣同步采用本實(shí)驗(yàn)方案和濾膜法進(jìn)行大腸菌群的檢測(cè).濾膜法的檢測(cè)步驟參照《GB/T5750.12-2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》中的要求[13].測(cè)量結(jié)果如圖10,相關(guān)系數(shù)為0.979.

圖10 濾膜法測(cè)量大腸菌群數(shù)目與本方案測(cè)量結(jié)果對(duì)比Figure 10 Comparison with the filter membrane method

5 結(jié)語(yǔ)

本文基于生長(zhǎng)時(shí)間光譜法設(shè)計(jì)了大腸菌群快速檢測(cè)儀器.采用分光光度法對(duì)大腸菌群的指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行檢測(cè);通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了625 nm作為分光光度檢測(cè)波長(zhǎng);設(shè)計(jì)采用了雙積分球光路結(jié)構(gòu),提高了儀器對(duì)透過(guò)率的測(cè)量穩(wěn)定性,采用樣品從實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的初始透過(guò)率降低至初始透過(guò)率的70%時(shí)所需時(shí)間作為生長(zhǎng)時(shí)間,顯著降低了檢測(cè)所需時(shí)間,對(duì)大腸菌群100 cfu/mL的檢測(cè),只需要276 min.建立了大腸菌群的生長(zhǎng)時(shí)間與大腸菌群的初始菌落數(shù)的數(shù)學(xué)模型.設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了本方案平行樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.61%;與濾膜法進(jìn)行比對(duì),相關(guān)系數(shù)0.979.下一步工作計(jì)劃把本方案應(yīng)用于單增李斯特、沙門氏菌、志賀氏菌等其它檢測(cè)應(yīng)用中.