田志龍，劉秋月，王翔宇，狄 冉，胡文萍，王玉琴，張效生，張金龍，儲明星*

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2. 河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471003；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

綿羊產(chǎn)羔數(shù)是一個極其復(fù)雜的性狀，受諸多因素影響。大多數(shù)綿羊?qū)儆诩竟?jié)性發(fā)情、單羔品種，且綿羊產(chǎn)羔性狀的遺傳力較低，僅為0.1左右，常規(guī)育種技術(shù)在短期內(nèi)很難改良產(chǎn)羔性狀。因此，如何較快提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)是養(yǎng)羊業(yè)亟待解決的難題。雌激素受體和孕激素受體都屬于類固醇核受體超家族[1]。綿羊雌激素受體α由 ESR1基因（Estrogen Receptor 1）編碼，具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的功能，通過與靶基因上的特異性效應(yīng)元件相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達[2]。雌激素受體α與雌激素結(jié)合后，對胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生長發(fā)育都發(fā)揮著重要作用[3]。國內(nèi)外許多研究證實ESR基因是調(diào)控豬高產(chǎn)仔數(shù)的主效基因之一[4]。Hewitt 等[5]研究表明，敲除ESR基因后將導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)促黃體生成素（LH）調(diào)節(jié)紊亂、卵巢不排卵等現(xiàn)象。研究表明，ESR基因與小尾寒羊[6]和湖羊[7]多羔繁殖緊密相關(guān)。孕激素受體（Progesterone Receptor，PGR）屬于甾體激素核受體家族的成員，是配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，可與孕激素結(jié)合后發(fā)揮生理功能，在動物的發(fā)育、生殖、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著十分重要的作用[8-9]。許多研究表明PGR信號傳導(dǎo)是卵母細胞排卵所必須的[10]。Rowan等[11]發(fā)現(xiàn)，PGR缺失小鼠成年后大腦、子宮、卵巢均發(fā)生表型變化，并且無法排卵。綜上可知，ESR和PGR基因在動物繁殖中存在重要的作用，但其在不同繁殖力小尾寒羊群體的表達研究并不多見。

綿羊FecB基因是學(xué)術(shù)界公認影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因[12]。在實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)在小尾寒羊群體中FecB基因野生型個體中存在產(chǎn)多羔的現(xiàn)象。使用Taqman探針法對小尾寒羊進行分型，選擇FecB基因突變野生型小尾寒羊，連續(xù)觀察黃體數(shù)并記錄產(chǎn)羔數(shù)（產(chǎn)羔數(shù)和黃體數(shù)均大于或等于2，則定義為多羔）。本研究獲得小尾寒羊FecB基因突變野生型單羔群體和多羔群體（下文簡稱單羔、多羔），采用反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù)檢測ESR1和PGR基因在不同繁殖力小尾寒羊群體中的表達差異，期望從轉(zhuǎn)錄水平初步揭示ESR1和PGR基因在綿羊多羔繁殖中的作用，為深入研究綿羊多羔性狀機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和主要試劑 小尾寒羊（FecB野生型單羔和多羔）來自天津市畜牧獸醫(yī)研究所種羊場。挑選健康狀況良好的成年母羊各3只，使用陰道孕酮栓（Controlled Internal Drug Release，CIDR）進行同期發(fā)情處理，12 d后撤栓。在撤栓后45 h屠宰并立即采集大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟12種組織，液氮中保存，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司（北京），2×Taq PCR Master Mix購于北京拓英坊生物技術(shù)有限公司（北京），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）和熒光定量染料（SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ）均購于TaKaRa公司（大連）。

1.2 組織總RNA的提取和檢測 采用動物組織總RNA提取試劑盒提取各組織總RNA，并用NanoDrop 2000檢測提取RNA的純度和濃度，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank提供的綿羊ESR1和PGR基因mRNA序列（登錄號分別為XM_012137956.2、XM_012169084.2），利用Primer Premier 6.0軟件進行跨外顯子引物設(shè)計，以GAPDH（NM_001190390.1）作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。引物名稱和序列、退火溫度以及擴增片段大小見表1。

1.4 cDNA合成 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer（for Real Time）4.0 μL， 總 RNA 1.0 μg，RNase-Free ddH2O補足至總體積為20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃ 5 s，獲得cDNA第1鏈。全程在冰上操作。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行5倍稀釋，用持家基因GAPDH進行PCR檢測，將符合標準的cDNA置于-20℃保存，以用于檢測目的基因的表達。

1.5 RT-PCR反應(yīng) PCR體系總體積為20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L 的上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性 5 min；95℃ 變 性 30 s，60℃ 退 火 30 s，72℃ 延 伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。

1.6 實時熒光定量 PCR 利用 Roche Light Cycler?480 Ⅱ型熒光定量PCR儀進行熒光定量檢測，反應(yīng)體系總體積為 20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，10 μmol/L的上、下游引物各 0.8 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL，cDNA 模 板 2 μL。PCR程 序：95℃ 預(yù) 變 性 5 s，95℃變性10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后對熔解曲線進行分析。以GAPDH基因為內(nèi)參基因，每個樣品重復(fù)檢測3次。

1.7 統(tǒng)計分析 采用 2-△△Ct法[13]計算目的基因相對表達量，用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA分析，使用LSD法進行多重比較，所有數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與cDNA合成 提取不同繁殖力小尾寒羊各組織的總RNA，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。28 S和18 S條帶清晰可見，且灰度值約為2:1，而5 S帶幾乎沒有，說明提取的總RNA無明顯降解。Nanodrop 2000檢測各組織RNA，A260/A280均在1.8～2.1，表明提取的RNA純度較高，可用于后續(xù)的熒光定量PCR反應(yīng)。

表 1 綿羊ESR1和PGR基因的引物信息

2.2 綿羊ESR1、PGR基因組織表達譜 如圖1所示，GAPDH基因在小尾寒羊不同組織表達擴增效果良好，具有明顯內(nèi)參基因特征。小尾寒羊多羔群體中ESR1基因在子宮、輸卵管、卵巢、垂體中高度表達；在大腦、小腦、下丘腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織微弱表達。PGR基因在小尾寒羊多羔群體的輸卵管、子宮、卵巢高表達，在其他組織微弱表達。小尾寒羊單羔群體中ESR1、PGR基因的表達模式與多羔群體類似。

圖1 多羔小尾寒羊（A）和單羔小尾寒羊（B）各組織中ESR1和PGR基因的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.3 綿羊下丘腦-垂體-卵巢軸相關(guān)組織中ESR1和PGR基因的表達 如圖2所示，ESR1基因在小尾寒羊子宮、輸卵管的表達量最高，其次是在卵巢，在下丘腦、垂體的表達量最低。ESR1基因在多羔小尾寒羊子宮、卵巢、輸卵管、垂體和下丘腦組織中的表達量與單羔小尾寒羊無顯著差異（P＞0.05）。PGR基因在小尾寒羊輸卵管、子宮的表達量最高，其次是卵巢，在下丘腦、垂體組織的表達量最低。PGR基因在多羔小尾寒羊輸卵管、子宮、卵巢和下丘腦中的表達量均極顯著高于單羔小尾寒羊（P＜0.01）；在垂體組織的表達量顯著高于單羔小尾寒羊（P＜0.05）。

圖 2 ESR1、PGR基因在不同群體小尾寒羊的組織表達

3 討 論

3.1 ESR1基因表達對動物繁殖的影響 研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體與雌激素結(jié)合后，對胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，ESR1基因在卵泡期不同繁殖力小尾寒羊群體的子宮、輸卵管的表達量最高，其次是在卵巢，在下丘腦、垂體組織的表達量最低。丁威[15]發(fā)現(xiàn)，在豬早期階段卵巢中雌激素受體主要在卵巢表皮細胞、卵母細胞巢中的卵原細胞和卵母細胞以及原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞的核中表達。白淑等[16]使用免疫組織和熒光定量技術(shù)檢測濟寧青山羊出生后發(fā)育過程中雌激素受體在子宮的定位及表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雌激素受體1在子宮腔上皮、腺上皮、基質(zhì)、血管內(nèi)皮和平滑肌細胞的胞核中均有表達，證明了雌激素受體1參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜與肌層的增殖和分化。劉欣[17]以成年母牛為研究對象，發(fā)現(xiàn)卵泡期ESR1和PGR在卵巢中表達量最高，其次是輸卵管，子宮最低。Laws等[18]在小鼠中發(fā)現(xiàn)下丘腦-垂體-卵巢軸ESR1信號異常會導(dǎo)致卵巢上皮腫瘤的發(fā)生。ESR1過表達后，會對甲氧氯的敏感性增強，可能導(dǎo)致卵泡閉鎖[19]。Winuthayanon等[20]研究證明，雌激素通過ESR1作用于子宮基質(zhì)發(fā)揮其生理功能，之后通過ESR1作用于子宮上皮繼續(xù)發(fā)揮功能，推測可能是其與雌激素作用誘導(dǎo)子宮細胞增殖分化[21]。Pawar等[22]研究證明，ESR1在雌性動物子宮基質(zhì)細胞分化及子宮蛻膜化的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Cerny等[23]通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，認為雌激素和ESR1結(jié)合后調(diào)節(jié)輸卵管相關(guān)基因的表達和生理作用。本研究中ESR1在子宮中的高表達量可能是由于埋植陰道栓刺激所致；ESR1基因在小尾寒羊單、多羔群體子宮、輸卵管、卵巢的組織均有表達，暗示ESR1可能在小尾寒羊發(fā)情或者排卵的過程中起著重要作用，但具體機制有待繼續(xù)研究。

3.2 PGR基因表達對動物繁殖的影響 研究發(fā)現(xiàn)，孕激素受體在動物機體的所有主要生理系統(tǒng)中低表達，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和雌性動物生殖道中高表達[24]。本研究通過熒光定量PCR檢測了卵泡期小尾寒羊單羔和多羔群體下丘腦-垂體-性腺軸繁殖調(diào)控組織PGR基因的表達差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGR主要在輸卵管、子宮、卵巢、垂體、下丘腦表達，這和嚙齒動物、哺乳動物表達模式相似。如在豬的發(fā)情期和妊娠早期的子宮組織[25]以及在嚙齒動物卵巢[10]、輸卵管[26]組織均能檢測到PGR基因的表達。PGR缺失小鼠成年后大腦、子宮、卵巢均發(fā)生表型變化，并且無法排卵[11]。本研究還發(fā)現(xiàn)，PGR在小尾寒羊多羔群體輸卵管、子宮、卵巢、下丘腦的表達量極顯著高于單羔群體；在多羔群體垂體中的表達量顯著高于單羔群體。Chen等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，PGR基因在高繁殖力的策勒黑羊群體的表達量高于低繁殖力的和田羊，這和本研究的結(jié)果一致，PGR基因存在多態(tài)位點可以影響小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)[28]。這些結(jié)果暗示PGR基因參與小尾寒羊多羔性狀的調(diào)控。

4 結(jié) 論

本研究通過RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ESR1和PGR基因在小尾寒羊單、多羔群體大腦、小腦、下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織均有表達；熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)ESR1、PGR基因分別在小尾寒羊子宮和輸卵管組織中高表達；PGR基因在多羔群體下丘腦-垂體-卵巢軸組織中的表達量顯著高于單羔群體，暗示PGR在小尾寒羊多羔性狀的調(diào)節(jié)過程中起到一定作用。