朱 樺，潘家華，徐新明，付雪峰，田月珍，阿布來(lái)提·蘇來(lái)曼，黃錫霞*，田可川*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧科學(xué)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

蘇博美利奴羊是以進(jìn)口澳洲美利奴超細(xì)型公羊?yàn)楦副?，以中?guó)美利奴羊、新吉細(xì)毛羊和敖漢細(xì)毛羊?yàn)槟副?，采用?jí)進(jìn)雜交方法，經(jīng)過(guò)雜交、橫交和純繁選育3個(gè)階段、歷經(jīng)14年培育出的超細(xì)型細(xì)毛羊新品種，該品種成年公、母羊肩胛部平均羊毛細(xì)度分別可達(dá)16.42、17.85 μm[1]。而橋粒是上皮細(xì)胞特有的一種細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)，位于中間連接的深部，角質(zhì)形成細(xì)胞之間借助橋粒相互連接[2]。橋粒芯糖蛋白（Desmoglein，Dsg）屬于鈣離子依賴型的橋粒鈣黏蛋白，它是構(gòu)成橋粒的重要部分[3]。橋粒芯糖蛋白4（Desmoglein 4，Dsg4）是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的橋粒鈣黏蛋白家族成員，是毛囊角化細(xì)胞間黏附的重要介質(zhì)[4]。Dsg4基因突變會(huì)導(dǎo)致局限型常染色體隱性遺傳性多毛癥（LAH）疾病的發(fā)生，其臨床癥狀表現(xiàn)為頭皮、軀干和四肢毛發(fā)短而稀疏[5-6]。Dsg4基因突變也會(huì)導(dǎo)致全身性的先天性毛發(fā)營(yíng)養(yǎng)不良、發(fā)干粗細(xì)不均的念珠狀發(fā)（Monilethrix）特征[7]。而且Dsg4基因與遼寧絨山羊的毛色[8]、與綿羊肩胛部毛的長(zhǎng)度以及卷曲數(shù)相關(guān)[9-10]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于Dsg4基因在細(xì)毛羊毛囊不同發(fā)育時(shí)期及不同組織的表達(dá)差異研究較少。蘇博美利奴羊在胎齡65 d初級(jí)毛囊開(kāi)始發(fā)生形成毛芽，胎齡85 d次級(jí)毛囊開(kāi)始發(fā)生，胎齡105 d時(shí)原始次級(jí)毛囊大量分化為次級(jí)毛囊，胎齡135 d時(shí)大多數(shù)毛囊基本成熟[11]。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Dsg4基因在蘇博美利奴羊毛囊發(fā)育6個(gè)時(shí)期皮膚組織中的表達(dá)，并挑選出毛囊發(fā)育的2個(gè)關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行不同組織中的差異表達(dá)研究，以期進(jìn)一步揭示細(xì)毛羊毛囊發(fā)育的生物學(xué)過(guò)程，為篩選可用于細(xì)毛羊毛囊發(fā)育相關(guān)的候選基因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 在新疆科創(chuàng)畜牧繁育中心選取30只2周歲左右健康無(wú)病、體況均勻的經(jīng)產(chǎn)蘇博美利奴母羊（羊毛平均纖維直徑約17.73 μm），采用同一公羊的精液進(jìn)行同期受孕，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同。采集同為公羔的胚胎期 65 d（初級(jí)毛囊發(fā)生）、85 d（次級(jí)毛囊發(fā)生）、105 d（次級(jí)獲得性毛囊發(fā)生）、135 d（毛囊成熟）、出生后7 d和出生后30 d的肩胛部皮膚組織，并采集胚胎期 65 d和135 d的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、肌肉組織保存于液氮中，不同時(shí)期不同組織均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用于總RNA的提取實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)于TaKaRa公司。

1.3 不同組織總RNA提取及cDNA合成 使用Trizol法提取蘇博美利奴羊7種不同組織的總RNA。提取的總RNA先利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性；另取2 μL總RNA使用核酸檢測(cè)儀進(jìn)行濃度測(cè)定；最后將提取的總RNA濃度調(diào)到400 ng/μL。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA第1鏈合成。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 根據(jù)NCBI中公布的綿羊Dsg4基因序列（登錄號(hào)：XM_012103430.1）及綿羊GAPDH基因序列（登錄號(hào)：NM_001190390.1），利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，進(jìn)行Dsg4基因和GAPDH基因的 PCR 擴(kuò)增：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 1 μL，dH2O 8 μL（總體系為 20 μL），擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 3 min，94℃ 30 s，61℃ 45 s，35個(gè) 循 環(huán)，72℃ 5 min。 隨 機(jī) 挑 選 4個(gè)PCR 產(chǎn)物取 3 μL 與2 μL 6×Loading Buffer混勻，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，180 V，20 min；后使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，若獲得的產(chǎn)物片段大小與預(yù)期一致則進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，進(jìn)行Dsg4基因和Gapdh基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 1 μL，dH2O 10.5 μL（總體系為25 μL），擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 30 s，95℃ 5 s，61℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)，65℃ 5 s，95℃ 5 s。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 獲得的Ct值最終以2-△△Ct方法目的基因表達(dá)量的計(jì)算，ΔCt=Ct目的-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt目的組-ΔCt對(duì)照組，并用SPSS 19.0軟件單因素方差分析中的Duncan′s多重比較對(duì)表達(dá)量結(jié)果進(jìn)行差異比較。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織的總RNA檢測(cè) 提取的總RNA隨機(jī)抽選4個(gè)樣品，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行其完整性的檢測(cè)。從圖1可明顯看出，28S是18S條帶亮度的2倍，5S條帶不明顯，說(shuō)明提取的總RNA完整性好且無(wú)降解；利用核酸檢測(cè)儀進(jìn)行總RNA的濃度測(cè)定，所有樣品濃度均在 350 ng/μL 以上，且 OD260/OD280在 1.8～2.0，表明提取的總RNA濃度高且無(wú)蛋白質(zhì)、DNA等污染，符合后期反轉(zhuǎn)錄的要求，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

圖1 總RNA檢測(cè)結(jié)果

表1 引物信息

2.2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果 Dsg4基因和GAPDH基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)在117 bp和113 bp處有明顯的條帶（圖2），與預(yù)期產(chǎn)物大小一致，表明擴(kuò)增體系合理，反轉(zhuǎn)錄的cDNA可用于后續(xù)的定量實(shí)驗(yàn)。

圖2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)圖

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析（圖3），Dsg4基因和GAPDH基因有且只有1個(gè)峰，Dsg4基因熔解溫度為82.7℃，GAPDH基因熔解溫度為84.2℃，熔解溫度均一，且擴(kuò)增曲線指數(shù)良好，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)，結(jié)果真實(shí)可靠。

圖3 Dsg4和Gapdh的擴(kuò)增曲線及熔解曲線

2.3 Dsg4在胚胎期65 d各組織中的表達(dá) Dsg4基因在胚胎期65 d不同組織中的表達(dá)結(jié)果中，肝臟的ΔCt值最小，因此將肝臟作為對(duì)照組進(jìn)行表達(dá)量的計(jì)算。從圖4可以看出，Dsg4基因在肝臟組織中的表達(dá)量分別是心臟、脾臟、肺、腎臟、肌肉和皮膚組織中的4.55、12.50、10.00、1.85、11.11和 5.26倍（P＜0.01）；Dsg4基因在腎臟中的表達(dá)量極顯著高于脾臟、肺和肌肉的表達(dá)量（P＜0.01），且顯著高于心臟和皮膚的表達(dá)量（P＜0.05）；但Dsg4基因在心臟、脾臟、肺、肌肉和皮膚之間的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 Dsg4在胚胎期135 d各組織中的表達(dá) Dsg4基因在胚胎期135 d不同組織中的表達(dá)結(jié)果中皮膚的ΔCt值最小，因此將皮膚作為對(duì)照組進(jìn)行表達(dá)量的計(jì)算。從圖5可以看出，Dsg4基因在皮膚組織中的表達(dá)量分別是心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和肌肉組織中的4.35、5.00、4.35、6.67、16.67和 12.50倍（P＜0.01）， 且Dsg4基因在心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和肌肉6個(gè)組織間的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 Dsg4在毛囊發(fā)育6個(gè)時(shí)期皮膚組織中的表達(dá) 以胚胎期65 d作為對(duì)照組進(jìn)行毛囊不同發(fā)育時(shí)期Dsg4基因表達(dá)量的計(jì)算。從圖6可以看出，Dsg4基因的表達(dá)量隨著毛囊發(fā)育的成熟呈逐步上升的趨勢(shì)，在出生后30 d表達(dá)量極顯著高于胚胎期65、85 、105 、135 d的表達(dá)量（P＜0.01）；在出生后7 d 的表達(dá)量極顯著高于胚胎期 65 、85 、105 d 的表達(dá)量（P＜0.01）。

圖4 Dsg4在蘇博美利奴羊胚胎期65 d不同組織中的表達(dá)量

圖5 Dsg4在蘇博美利奴羊胚胎期135 d不同組織中的表達(dá)量

圖6 Dsg4在蘇博美利奴羊毛囊發(fā)育不同時(shí)期皮膚組織中的表達(dá)量

3 討 論

中國(guó)美利奴羊（甘肅型）在胚胎期84 d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)初級(jí)毛囊，胚胎期87 d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)次級(jí)毛囊，胚胎期102 d和108 d時(shí)在原始次級(jí)毛囊開(kāi)始分化，胚胎期138 d時(shí)大部分毛囊發(fā)育成熟[12]。本研究利用蘇博美利奴羊胚胎期65、85、105、135 d和出生后7、30 d的皮膚組織，以及胚胎期65 d和135 d的不同內(nèi)臟組織進(jìn)行Dsg4基因毛囊不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量的研究分析。

本研究采用的熒光定量方法為熒光染料法。熒光染料法主要是利用熒光染料與DNA雙鏈結(jié)合，之后檢測(cè)相結(jié)合的熒光強(qiáng)度的一種方法[13]。采用相對(duì)定量是在進(jìn)行目的基因測(cè)定的同時(shí)還要進(jìn)行某個(gè)內(nèi)參基因的測(cè)定[14]。不同的研究條件需要選擇相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因，常用的內(nèi)參基因有GAPDH、β-actin、18S rRNA等[15-16]。本研究中采用GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，該內(nèi)參基因在不同組織中的表達(dá)量一直處于穩(wěn)定狀態(tài)，該基因在重復(fù)實(shí)驗(yàn)間Ct值相近，這與田月珍等[17]研究中國(guó)美利奴羊（新疆型）皮膚組織GAPDH基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果一致。

Smad4基因缺失會(huì)導(dǎo)致脫發(fā)[18]，Smad4缺失會(huì)導(dǎo)致Dsg4基因的下調(diào)，最終會(huì)使毛囊發(fā)生變性[19]；Hoxc13功能缺失亦會(huì)導(dǎo)致Dsg4基因的下調(diào)，導(dǎo)致無(wú)毛癥的發(fā)生[20]；但Dsg4基因突變不僅會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)毛發(fā)稀少的表型[21]，也會(huì)造成披針形毛發(fā)的表型出現(xiàn)[22]，不會(huì)引起其他病理癥狀。這些研究均表明Dsg4基因?qū)γ矣兄种匾淖饔?。Bazzi等[23]研究表明，Dsg4基因高度表達(dá)在毛發(fā)角蛋白的毛干皮層中，這與本研究的Dsg4基因在蘇博美利奴羊毛囊發(fā)育成熟時(shí)期皮膚組織中表達(dá)最高的結(jié)果一致。Gao等[24]比較絨山羊胎兒皮膚轉(zhuǎn)錄組的毛囊形態(tài)發(fā)生相關(guān)關(guān)鍵基因結(jié)果分析，表明Dsg4基因從絨山羊胚胎期60 d到胚胎期120 d再到出生后2 h皮膚組織中的表達(dá)量逐步上調(diào)，這與本研究的Dsg4基因隨著毛囊發(fā)育逐步的成熟，從胚胎期65 d到出生后30 d表達(dá)量上調(diào)的結(jié)果一致。本研究表明，隨著蘇博美利奴羊毛囊發(fā)育的逐步成熟，Dsg4基因的表達(dá)量也隨之逐步上調(diào)，表明Dsg4基因可能對(duì)于毛囊的成熟呈正向的調(diào)節(jié)作用，為今后研究超細(xì)毛羊的毛囊發(fā)育提供了重要依據(jù)。

4 結(jié) 論

Dsg4基因在蘇博美利奴羊胚胎期65 d肝臟中表達(dá)量極顯著高于其他組織，而到胚胎期135 d時(shí)皮膚組織中表達(dá)量極顯著高于其他組織，并且隨著毛囊發(fā)育的逐步成熟，Dsg4基因在皮膚中的表達(dá)量也逐步上調(diào)，這表明Dsg4基因可能與毛囊成熟的生理過(guò)程密切相關(guān)，可為今后進(jìn)一步研究蘇博美利奴羊毛囊發(fā)育提供理論依據(jù)。