楊 鑫，周曉紅

(重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫(yī)院，重慶 400030)

人造血干細(xì)胞(HSCs)具有自我更新能力并能分化為各種血細(xì)胞前體細(xì)胞，最終生成各種血細(xì)胞成分(包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板)，HSCs也可以分化成其他細(xì)胞。有研究者在1961年通過“脾集落形成試驗”，首先描述了HSCs的特性。威斯康星大學(xué)的THOMSON等[1]在1988年成功建立了胚胎干細(xì)胞系。在此之后，HSCs被進(jìn)一步分化為神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、胰島細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等[2-5]。HSCs良好的分化增殖能力對患者損傷組織的修復(fù)具有重要意義,使得干細(xì)胞能更加廣泛地應(yīng)用于臨床。溫度在細(xì)胞的培養(yǎng)條件中至關(guān)重要，有研究發(fā)現(xiàn)溫度環(huán)境對細(xì)胞的生長和凋亡有影響[6-9]。目前關(guān)于溫度影響HSCs生長和凋亡方面的報道較少。因此，本研究以溫度作為干預(yù)條件，觀察不同溫度下體外培養(yǎng)HSCs的生長及凋亡情況，為進(jìn)一步科研和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 上海拜沃生物科技有限公司提供HSCs。

1.2儀器與試劑 RPMI1640培養(yǎng)液(上海元龍生物技術(shù)有限公司)，IMDM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，Metho CultTMHCC4230培養(yǎng)基(加拿大Stem cell Technologies Inc公司)，Annextin V(美國Becton,Dickinson and Company)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)，LHC-250-Ⅰ恒溫恒濕二氧化碳培養(yǎng)箱(北京陸?？萍加邢薰?，CKC-TR-2W型倒置顯微鏡(Olympus公司)，YJ-875型超凈化工作臺(蘇州安泰凈化設(shè)備廠)，6孔培養(yǎng)板(北中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京碧波生物科技有限公司)，BD-CAN7型流式細(xì)胞儀(美國 Becton,Dickinson and Company)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) HSCs采用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3.2不同溫度的細(xì)胞培養(yǎng)處理 將HSCs分成實驗組和對照組。實驗組細(xì)胞在恒溫恒濕二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的溫度分別設(shè)定為33、35、39、41 ℃；對照組細(xì)胞在恒溫恒濕二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的溫度設(shè)定為37 ℃。

1.3.3紅系集落形成單位(CFU-E)集落培養(yǎng) 采用Metho CultTMHCC4230培養(yǎng)基，0.9 mL培養(yǎng)基加入0.1 mL的細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為每升2×109個)，用IMDM補充為1 mL，充分混勻后轉(zhuǎn)移至35 mm的6孔培養(yǎng)板，每個標(biāo)本重復(fù)5孔，置不同溫度下培養(yǎng)，飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)4、7、10 d分別計數(shù)CFU-E集落，以含50個細(xì)胞以上的細(xì)胞團為1個集落。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率 采用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，0.9 mL培養(yǎng)基加入0.1 mL的細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為每升2×109個)，用IMDM補充為1 mL，將HSCs在不同溫度下分別培養(yǎng)6、12、24 h，使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，通過流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率。

1.3.5相關(guān)性分析 不同溫度(33、35、37、39、41 ℃)下培養(yǎng)6、12、24 h，研究不同溫度變化和流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率的相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1HSCs染色結(jié)果 經(jīng)HE染色，細(xì)胞呈扁平狀向外延伸生長，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)呈紅色，見圖1。

圖1 HSCs染色結(jié)果(HE，×400)

2.2CFU-E集落分析結(jié)果 培養(yǎng)4 d，37 ℃組(對照組)CFU-E集落數(shù)最高，33 ℃組和35 ℃組與37 ℃組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)7 d，37 ℃組CFU-E集落數(shù)最高，33 ℃組、41 ℃組與37 ℃組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)10 d，37 ℃組CFU-E集落數(shù)最高，33 ℃組與37 ℃組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 CFU-E集落分析個)

注：與37 ℃組比較，*P<0.05

2.3流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率 培養(yǎng)6 h，33 ℃組HSCs凋亡率最低，33 ℃組、35 ℃組與37 ℃組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)12 h，33 ℃組HSCs凋亡率最低，35 ℃組、39 ℃組與37 ℃組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)24 h，33 ℃組HSCs凋亡率最低，35 ℃組、41 ℃組與37 ℃組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率%)

注：與37 ℃組比較，*P<0.05

2.4相關(guān)性分析 分別培養(yǎng)6、12、40 h，在不同溫度下流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率：培養(yǎng)6 h后溫度變化與流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率具有相關(guān)性(r=0.888,P<0.01)；培養(yǎng)12 h后溫度變化與流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率具有相關(guān)性(r=0.795,P<0.01)；培養(yǎng)24 h后溫度變化與流式細(xì)胞儀檢測HSCs凋亡率具有相關(guān)性(r=0.834,P<0.01)。

3 討 論

HSCs在一定的溫度條件下才能維持生命和代謝，根據(jù)細(xì)胞周圍環(huán)境中溫度的差異，其生物學(xué)行為也會隨之表現(xiàn)不同。細(xì)胞在人體內(nèi)生存的平均溫度為37 ℃，因此目前細(xì)胞培養(yǎng)大多采用37 ℃作為標(biāo)準(zhǔn)溫度。溫度的變化對細(xì)胞的生長和凋亡存在一定的影響，溫度的變化也促成了胚胎發(fā)育和多種病變的發(fā)展[10-14]。但目前對于HSCs的培養(yǎng)多采用常溫環(huán)境，這與其在體內(nèi)存在的具體環(huán)境存在一定的差異，因此采用不同溫度培養(yǎng)HSCs可更加真實地模擬其體內(nèi)外的生長環(huán)境。

作為前體細(xì)胞的HSCs最大的特點就是具有高度自我更新、自我修復(fù)和多向分化的能力。HSCs的復(fù)制、增殖、多向分化、歸巢后重建造血、凋亡等生物功能受到周圍各種環(huán)境因素的影響。HSCs主要生存于骨髓區(qū)、靜脈血、動脈血中，37 ℃是其生存的平均溫度，人體各個器官和組織的溫度存在差異，在HSCs移植過程中溫度也必然發(fā)生變化，溫度的變化也將影響HSCs的各項生物學(xué)功能[15]。本研究中將各組溫度設(shè)定為33、35、37、39、41 ℃，正是要觀察HSCs在不同溫度下的生長情況，而關(guān)于這方面的研究國內(nèi)外報道較少。

本研究發(fā)現(xiàn)HSCs培養(yǎng)4、7、10 d，37 ℃組CFU-E集落數(shù)最高；HSCs培養(yǎng)6、12、24 h，33 ℃組HSCs凋亡率最低。由此推測，不同溫度對HSCs的生長和凋亡有影響。37 ℃能促進(jìn)HSCs的生長，溫度降低可以抑制HSCs的凋亡,為今后的臨床試驗提供了依據(jù)。