謝瑞芝，黎必非，練殊，李書慧，賈力

福州大學(xué)腫瘤轉(zhuǎn)移預(yù)警和預(yù)防研究所，福州 350116

腫瘤患者的病死率與疾病診斷的時(shí)期有關(guān)，90%以上的腫瘤患者死亡是由于發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移[1-4]。早在十多年前，就有學(xué)者提出了腫瘤細(xì)胞可以在早期生長(zhǎng)過程中脫離原發(fā)腫瘤，具有較弱的侵襲能力[5]；但是目前腫瘤分期程序和高分辨率影像技術(shù)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的探測(cè)均不夠敏感，不能探測(cè)到腫瘤進(jìn)程中的關(guān)鍵步驟：腫瘤微小轉(zhuǎn)移或者早期腫瘤侵襲[6]。多年來，很多用于探測(cè)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）的程序被開發(fā)，但其敏感度和特異度均不高[7-11]。直到20世紀(jì)70年代中期，一個(gè)檢測(cè)CTC的重大發(fā)現(xiàn)：上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）以不同水平在上皮細(xì)胞和上皮腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，Ep-CAM也存在于血液細(xì)胞中[12]，后續(xù)研究也證實(shí)了這個(gè)發(fā)現(xiàn)[13-14]。之后Riethmüller團(tuán)隊(duì)開創(chuàng)首個(gè)Ep-CAM富集方法，并聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)用于腫瘤患者的CTC檢測(cè)[15]。后來CellSearch自動(dòng)化系統(tǒng)獲得了廣泛關(guān)注，該系統(tǒng)已經(jīng)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌中CTC的檢測(cè)[16]。目前，以EpCAM為基礎(chǔ)的CTC檢測(cè)方法是應(yīng)用最普遍的CTC檢測(cè)方法之一。值得注意的是，很多證據(jù)表明，CTC由上皮腫瘤細(xì)胞、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）細(xì)胞、混合（上皮和EMT陽性）腫瘤細(xì)胞、不可逆EMT陽性腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤干細(xì)胞（circulating tumor stem cell，CTSC）組成，具有多相性[8,17-20]，并不是所有的腫瘤細(xì)胞都有EpCAM表達(dá)。在EpCAM表達(dá)水平較低、非上皮表型CTSC和經(jīng)歷EMT的情況下，以EpCAM為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法無法檢測(cè)到CTC。這個(gè)檢測(cè)方法的靈敏度和特異度均較低，可能會(huì)低估CTC，尤其是CTSC和EMT陽性腫瘤細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要性。

1 CTC

CTC是多種類型的細(xì)胞，包括單細(xì)胞或者細(xì)胞群落。腫瘤細(xì)胞逃逸到循環(huán)系統(tǒng)以線狀或者塊狀出現(xiàn)，1天內(nèi)1 g腫瘤組織中有100萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)入血液[10,21]，但是只有極少數(shù)具有高度活性、轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中可以存活，相互聚集形成微小癌栓，并在一定的條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移病灶[21-23]。來源于原發(fā)腫瘤細(xì)胞（圖1）或者轉(zhuǎn)移器官并散布在外周血管的CTC具有高度異質(zhì)性，有強(qiáng)大的形成轉(zhuǎn)移病灶的能力[24-26]。CTC的分子特性被認(rèn)為是一個(gè)實(shí)時(shí)“液體活檢切片”，可能有利于腫瘤患者治療的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及個(gè)體治療，這些足以見證CTC在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中所扮演的重要角色[21,24,27]。假設(shè)在造血運(yùn)輸期間靶向CTC，在轉(zhuǎn)移高峰期和末期有效地抑制CTC，可以降低腫瘤患者的發(fā)病率和病死率。

圖1 外周血循環(huán)中的原發(fā)腫瘤細(xì)胞亞群

利用CTC的物理性質(zhì)和生物學(xué)特性從大量的血液細(xì)胞中分離CTC，生物學(xué)特性主要應(yīng)用于抗體免疫學(xué)，識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原（正向選擇）或者普通的白細(xì)胞分化群（cluster of differentiation，CD）抗原中的CD45（負(fù)向選擇）[10]。正向選擇是EpCAM抗體只分離表達(dá)EpCAM抗原的細(xì)胞[28]，這種方法的缺點(diǎn)是無法檢測(cè)表達(dá)水平較低的EpCAM、EpCAM-和非上皮表型CTC如CTSC和EMT陽性細(xì)胞，并且它們與抗體的分離需要外界破壞CTC表面EpCAM受體與EpCAM抗體之間的離子鍵，所以正向選擇分離的CTC的生存能力下降。通過物理方法或者負(fù)向選擇的上皮、非上皮顯性的CTC、CTSC、EMT陽性腫瘤細(xì)胞可以生存，但是所有通過物理方法和負(fù)向選擇分離的循環(huán)細(xì)胞不一定來源于腫瘤，它們可能來源于正常的血管、基質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞及其他在循環(huán)系統(tǒng)中很少存在的宿主細(xì)胞[7,11]。因此，通過物理方法和負(fù)向選擇分離CTC是混合的，需要進(jìn)一步純化才能使用，而正向選擇可以分離出高純度的、來源于腫瘤的CTC。

由于多重內(nèi)在和外在因素作用，導(dǎo)致CTC數(shù)量少，可塑，基因型和表型可變，CTC的探測(cè)仍然存在技術(shù)挑戰(zhàn)。CTC數(shù)量非常少并且多相，鑒定CTC及分析其特性需要富集和探測(cè)相結(jié)合，并且應(yīng)用敏感度和特異度強(qiáng)的分析方式。對(duì)大量的細(xì)胞用不恰當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)，不僅阻礙了對(duì)CTC的生物性質(zhì)的理解，也阻礙了對(duì)CTC的精細(xì)分析和功能研究。

2 EpCAM用于檢測(cè)CTC的缺陷

圖2 EpCAM的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象模型

表1 不同腫瘤細(xì)胞中的EpCAM表達(dá)情況

EpCAM是一種由314個(gè)氨基酸組成的I型跨膜糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為39～42，是同種抗原的上皮細(xì)胞間的黏附分子。這種糖蛋白可以被識(shí)別，如相對(duì)分子質(zhì)量為40的糖蛋白可以被單克隆抗體17-1A識(shí)別（圖2），該抗體也稱為ESA、Ber-EP4、MH99、 AUA1.MOC31、323/A3、KS1/4、GA733、HEA125等[29]，EpCAM 由 Litvinov 團(tuán)隊(duì)命名[30]。在一些健康成年人的正常組織和器官中，EpCAM高表達(dá)，并且大多數(shù)腫瘤有EpCAM表達(dá)，上皮組織的腫瘤通常呈EpCAM強(qiáng)陽性，非上皮組織的腫瘤呈EpCAM陰性，間充質(zhì)腫瘤僅顯示弱陽性或者偶有弱陽性[8,31]。在不同腫瘤組織中EpCAM表達(dá)情況不同（表1）[32]，并且不同腫瘤組織中EpCAM表達(dá)情況差異顯著[30,32]。

為了從血樣中一次性分離CTC，EpCAM抗體受到了重點(diǎn)關(guān)注。CellSearch系統(tǒng)的缺陷是靈敏度相對(duì)較低：在每毫升只有一個(gè)CTC且純度低的情況下，只有少部分的轉(zhuǎn)移癌患者檢測(cè)CTC呈陽性[19,28,33]。依據(jù)Seldinger導(dǎo)絲穿刺法[34]，一個(gè)新的、以EpCAM為基礎(chǔ)的、從未經(jīng)處理的血樣中分離CTC的單步富集方法被報(bào)道[35]。這個(gè)裝置可以成功地分離腫瘤各時(shí)期的CTC，包括未確診的腫瘤早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這種應(yīng)用于生物體內(nèi)的方法的優(yōu)點(diǎn)是可以以較大的血液樣本去捕獲CTC，特別是對(duì)于CTC較少的早期腫瘤患者，每次需要獲取大量的腫瘤患者的血液，才可以做到實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)展情況[18,36]。盡管以EpCAM為基礎(chǔ)的富集方法具有很大的潛力，但是靈敏度和特異度較低，因此基于EpCAM檢測(cè)CTC的方法還存在缺陷。

2.1 CTC存在多相性

CTC是由混合型細(xì)胞組成，包括上皮腫瘤細(xì)胞、EMT細(xì)胞、混合（上皮和EMT陽性）腫瘤細(xì)胞、不可逆EMT陽性腫瘤細(xì)胞和CTSC。因此，以Ep-CAM為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法無法檢測(cè)到EpCAM低表達(dá)的CTC、CTSC、EMT陽性和EpCAM-細(xì)胞。CSC是具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞的罕見亞型，不同的亞型有不同的功能屬性，并且在腫瘤進(jìn)展中具有多樣性，因此表面標(biāo)志物并不能明確地富集所有的CSC。到目前為止，研究人員已經(jīng)確定了一些表面標(biāo)志物，可以從大多數(shù)腫瘤類型的原發(fā)性腫瘤組織中富集各種CSC[17,26,37]。由于CSC的高度異質(zhì)性及大多數(shù)常規(guī)抗腫瘤療法根除患者體內(nèi)CSC的能力有限，所以復(fù)發(fā)初始階段的CSC必須被捕獲和表征[17,33]。

數(shù)據(jù)顯示，即使通過CellSearch系統(tǒng)，仍有三分之一的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者使用傳統(tǒng)的EpCAM方法無法檢測(cè)到CTC[38-39]，并且在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中僅三分之一的患者CTC中EpCAM+的事實(shí)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)[40-41]，另外大部分患有神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等的患者無法檢測(cè)到CTC[42]。CSC 可以表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，如 TWIST、SNAIL、SLUG轉(zhuǎn)錄因子均可以引起EMT[43]，EMT過程可能引起EpCAM的動(dòng)態(tài)表達(dá)[17,32,37]。與其他EMT陽性細(xì)胞一樣，CTSC可能也會(huì)下調(diào)包括Ep-CAM在內(nèi)的標(biāo)志物的表達(dá)水平和上調(diào)多種間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平。CTC具有多相性，包括上皮腫瘤細(xì)胞、EMT陽性腫瘤細(xì)胞和CTSC，這些細(xì)胞共同存在于外周血中，不同腫瘤細(xì)胞的EpCAM表達(dá)水平不同，以EpCAM為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法無法檢測(cè)到表達(dá)水平低的EpCAM和非上皮表型CTC，如CTSC、EMT陽性細(xì)胞和EpCAM-細(xì)胞。

2.2 EpCAM的動(dòng)態(tài)表達(dá)

EpCAM被發(fā)現(xiàn)后的很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，在整個(gè)腫瘤研究進(jìn)展中EpCAM的穩(wěn)定表達(dá)是不容置疑的事實(shí)，直到一個(gè)關(guān)于EpCAM動(dòng)態(tài)表達(dá)的文章[31,44]發(fā)表后，才發(fā)現(xiàn)如果僅依據(jù)單獨(dú)的EpCAM作為CTC的捕獲抗原，會(huì)錯(cuò)過對(duì)相關(guān)CTC的捕獲。數(shù)據(jù)表明，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入血液的過程中EpCAM表達(dá)下調(diào)，與原發(fā)性腫瘤或者轉(zhuǎn)移腫瘤相比，每個(gè)細(xì)胞的EpCAM分子表達(dá)量明顯降低（400 000vs49 700），腫瘤細(xì)胞EpCAM的下調(diào)阻礙了CTC的捕獲[28,31-32]。此外，處理小鼠時(shí)心臟注射和靜脈注射高表達(dá)的EpCAM腫瘤細(xì)胞后僅30 min EpCAM表達(dá)開始下調(diào)，注射4 h已經(jīng)檢測(cè)不到EpCAM的表達(dá)[18]。這個(gè)結(jié)果揭示了CTC中EpCAM表達(dá)變化迅速，似乎依賴于與體內(nèi)器官或者內(nèi)皮表面的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)證明，在EpCAM高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入血液后，EpCAM表達(dá)水平明顯降低，并且通過CD44+和CD47+可以成功分離CTC[18,45-46]。相關(guān)研究顯示，盡管在原發(fā)性腫瘤中EpCAM高表達(dá)，但是在食管癌患者的骨髓中檢測(cè)到的彌散性腫瘤細(xì)胞的數(shù)量減少，并且三分之二的食管癌患者有攜帶EpCAM-的散播腫瘤細(xì)胞（disseminated tumor cell，DTC）[44,47]。

2.3 存在不可逆的EMT陽性腫瘤細(xì)胞

當(dāng)發(fā)現(xiàn)EMT過程使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)紡錘形，具有流動(dòng)性、去極化、抗失巢凋亡、免疫逃逸、轉(zhuǎn)移特性時(shí)，依賴上皮標(biāo)志物的檢測(cè)方法的缺點(diǎn)就更加明顯。EMT是CTC和DTC表面EpCAM表達(dá)下調(diào)的重要觸發(fā)因素，可以下調(diào)上皮標(biāo)志物（EpCAM、細(xì)胞角蛋白）的表達(dá)水平以及上調(diào)多種間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平[17,48-49]。另外，基于體內(nèi)外研究驗(yàn)證，CTC作為上皮腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng)后，血小板衍生生長(zhǎng)因子促使其轉(zhuǎn)變?yōu)镋MT陽性腫瘤細(xì)胞，可見腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液后也可能發(fā)生EMT[43,46]，而進(jìn)一步分化的CSC EMT表型的亞群在腫瘤惡化中的作用仍然不確定[50]。CTC具有多相性，其中CTSC的亞群經(jīng)歷了EMT過程并固定在間充質(zhì)細(xì)胞中，不會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ぜ?xì)胞表型[17-18]。因此，在腫瘤研究以及其他檢測(cè)CTC中EMT陽性細(xì)胞存活率的研究中，區(qū)分這兩類EMT陽性細(xì)胞對(duì)確認(rèn)正確的表型十分重要。

最新研究發(fā)現(xiàn)，CTC中腫瘤細(xì)胞和CSC的EMT轉(zhuǎn)變發(fā)生在侵襲前和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散前[48,51-52]。轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌晚期患者與早期乳腺癌患者相比，轉(zhuǎn)移性CTC表達(dá)EMT相關(guān)蛋白的概率較高，如波形蛋白、纖連蛋白、鈣黏附蛋白-N和鈣黏附蛋白-O[52-54]。臨床認(rèn)為，相比于乳腺癌早期，CTC的EMT標(biāo)志物在腫瘤轉(zhuǎn)移中出現(xiàn)的頻率更高，而且相比于單獨(dú)使用上皮標(biāo)志物，EMT標(biāo)志物可以更好地預(yù)測(cè)惡性轉(zhuǎn)化[55]。因此對(duì)于接受同源造血干細(xì)胞移植和大劑量的化學(xué)治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，與EMT相關(guān)的標(biāo)志物同樣可以作為檢測(cè)CTC的標(biāo)志物[48]。最近出現(xiàn)一個(gè)新的標(biāo)志物——細(xì)胞表面波形蛋白，用于乳腺癌患者和結(jié)直腸癌患者EMT陽性的CTC檢測(cè)[56]。在對(duì)58例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的試驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)相比于EpCAM，細(xì)胞表面波形蛋白抗體顯示出更加優(yōu)異的靈敏度和特異度[17]。

3 小結(jié)

僅依靠基于細(xì)胞表面EpCAM表達(dá)水平的免疫親和富集方法，CTC中的EpCAM-、EMT陽性細(xì)胞和CTSC細(xì)胞會(huì)被遺失。使用EpCAM抗體的研究方法可能會(huì)低估CTC、EMT陽性和CTSC的重要性，尤其是EpCAM在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要性。有必要對(duì)CTC的分離技術(shù)作進(jìn)一步的研究，更重要的是自動(dòng)CellSearch系統(tǒng)不能作為所有新的CTC檢測(cè)技術(shù)的參考標(biāo)準(zhǔn)。一種類型的CTC通常同時(shí)表達(dá)多個(gè)表面生物標(biāo)志物并且一個(gè)生物標(biāo)志物有多種類型，單一CTC生物標(biāo)志物的技術(shù)不足以高效、特異地捕獲CTC，而多種多樣的抗體綴合物可以同時(shí)識(shí)別并結(jié)合具有更強(qiáng)親和力的細(xì)胞表型的生物標(biāo)志物，雙抗體綴合物可以靈敏、特異地捕獲目標(biāo)CTC，無論是體外靜態(tài)還是體內(nèi)動(dòng)態(tài)條件[57-59]。EpCAM-乳腺癌細(xì)胞系高頻表達(dá)CD146（與不良預(yù)后有關(guān)的原發(fā)乳腺癌的子標(biāo)志物），為了檢測(cè)Ep-CAM+的CTC，提倡聯(lián)合使用CD146抗體和Ep-CAM抗體[60]。同樣，聯(lián)合使用EpCAM抗體和細(xì)胞角蛋白抗體可以檢測(cè)EpCAM-或低表達(dá)角蛋白的CTC。最近，黏附分子CD49f（整合素α6亞單位）抗體與細(xì)胞角蛋白抗體聯(lián)用已被證實(shí)可以增強(qiáng)與EMT關(guān)聯(lián)的CTC檢測(cè)的效果[61]。充足的證據(jù)顯示，其他上皮CTC的標(biāo)志物包括CD176、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和黏蛋白1（mucin 1，Muc1），CTSC 表面標(biāo)志物有 CD26、CD44、CD133和CXC趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4），循環(huán)EMT陽性腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物有波形蛋白、纖連蛋白、鈣黏附蛋白-N和鈣黏附蛋白-O[18]。因此，未來的研究應(yīng)該是將EpCAM抗體與上皮CTC、CTSC、EMT陽性腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體結(jié)合，以達(dá)到最好的檢測(cè)效果。同時(shí)通過吐溫-20處理去除對(duì)EpCAM的掩蔽，可以有效地提高捕獲乳腺癌患者EpCAM低表達(dá)的CTC的能力[62]。CTC檢測(cè)的靈敏度取決于EpCAM抗體，所以建議同時(shí)使用不同的EpCAM抗體[18,63]。利用上皮腫瘤細(xì)胞、CTSC、EMT陽性和雜交細(xì)胞亞型表面的生物標(biāo)志物，可以提高基于EpCAM富集CTC方法的靈敏度及特異度。