廖 彥 林 翀 林明冠 鐘業(yè)騰 陳少文 蘇應仙 何 晶

(海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科,?？?70311)

肺結核是常見的呼吸道傳染病。研究顯示2015年全球的新發(fā)肺結核病例達1 040萬例，300多萬例患者死于結核病或包括結核菌感染在內(nèi)的雙重感染[1,2]。第四次全國結核病流行病學調(diào)查顯示，我國肺結核患者占全球肺結核患者的1/4，其中傳染性肺結核患者占40%，我國每年新發(fā)肺結核病例130萬例，死亡病例數(shù)達到了13萬，耐藥肺結核感染病例高達46%，是結核菌耐藥現(xiàn)象最嚴重的國家之一[3]。及時診斷和治療的肺結核患者可達到較高的臨床治愈率[4]，但在臨床工作中，肺結核與其他肺部疾病的鑒別診斷仍然是一個棘手的問題。影像學診斷是診斷肺結核的主要方式，在此基礎上，對患者痰結核病菌進行顯微鏡分析能夠進一步提高肺結核的檢出率，臨床醫(yī)生根據(jù)患者的臨床癥狀、痰結核菌檢驗結核、肺部影像學檢查結果可進行準確的診斷[5]。但是，一些特殊的肺結核患者可出現(xiàn)異常的全身或者呼吸系統(tǒng)臨床表現(xiàn)，極易出現(xiàn)誤診或漏診，特別是長期以來人們往往關注涂片陽性肺結核患者，而忽視了對涂片陰性肺結核的防控和治療，易引起感染的傳播和蔓延[6]。近年來，隨著高分辨力CT等新型影像診斷技術相繼應用于臨床，肺結核的診斷效率得到一定的提高，但仍然不足以滿足臨床需求，這也迫使臨床工作者對肺結核的診斷從經(jīng)驗性、X線影像和細菌學檢測手段為主的階段向分子生物學診斷發(fā)展[7]。結核菌患者還會出現(xiàn)炎癥相關蛋白酶類物質(zhì)的表達異常[8]?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一類可降解的細胞外基質(zhì)蛋白酶，在結構上具有極大同源性，是一組依賴Zn2+和Ca2+的超家族成員，對維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要意義，而在炎癥性疾病中，MMPs發(fā)揮溶解細胞外基質(zhì)和破壞基膜的作用。MMP-9參與了炎癥、血管形成和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等病理生理過程[9]。近年來的相關研究結果顯示，MMP-9在肺損傷和肺纖維化等病理過程均扮演著重要的角色，MMPs和其組織抑制因子(Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)比例的失衡是包括肺結核在內(nèi)的多種慢性肺部疾病發(fā)生和進展的重要機制[10]，故有望作為肺結核的診斷標志物，但也有的研究報道稱肺癌患者也可出現(xiàn)MMP-9的異常表達，因此，MMP-9是否能用于肺結核與肺癌、肺炎等的鑒別診斷仍然是一項飽受爭議的問題?；诖朔N研究現(xiàn)狀，本研究針對血清MMP-9在肺結核鑒別診斷中的價值進行了研究和分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2015年8月～2017年9月醫(yī)院收治的確診為肺結核、肺炎、肺癌患者及在醫(yī)院進行體檢的健康志愿者各60例作為研究對象，分別作為肺結核組、肺炎組、肺癌組和對照組，所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.1.1納入標準 肺結核患者均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)制訂的國際結核病控制條例及國家衛(wèi)計委制訂的肺結核病診斷標準，均經(jīng)痰液細菌學檢查、X線影像學檢查、肺組織病理學檢查或隨訪觀察確診。肺炎患者均符合人民衛(wèi)生出版社出版的《內(nèi)科學(第8版)》中的社區(qū)獲得性肺炎診斷標準，均經(jīng)X線影像學檢查、痰液病原菌或血清支原體抗體檢查確診。肺癌患者均經(jīng)纖維支氣管鏡檢查、術后病理學檢查確診，并經(jīng)肺部CT或MRI等影像學檢查證實。肺結核和肺癌患者均為初診病例，入組前未接受抗結核或抗腫瘤治療。對照組研究對象均為同期在醫(yī)院接受健康體檢者，均經(jīng)臨床檢查排除肺部疾病。

1.1.2排除標準 合并肝腎功能異常、自身免疫病或免疫缺陷、惡性腫瘤、肺外結核、其他肺部疾病或先天畸形、其他部位慢性炎癥的患者；具有結核病史、肺部手術史的患者；年齡小于18歲；妊娠或哺乳期患者。

1.2研究方法 所有受試者臨床干預前抽取靜脈血。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)對血清中的MMP-9水平進行檢測，ELISA試劑盒由美國Abeam公司生產(chǎn)。①按1∶2 000的稀釋度對血清樣本進行稀釋，取100 μl稀釋后的血清樣本與標準品、空白對照加入預包被抗體的96孔板；②于37℃下孵育2 h后每孔加入250 μl洗液洗板3次；③吸干水分后每孔加入100 μl生物素標記抗體，于37℃下孵育1 h后再次洗板；④每孔加入100 μl鏈霉素標記抗體，于37℃下孵育1 h后再次洗板，每孔加入100 μl底物后于37℃下孵育20～30 min；⑤每孔加入100 μl終止液后采用微孔板分光光度計(美國Bio-Rad公司生產(chǎn))于450 nm波長下讀取檢測樣品的吸光度；⑥通過標準品曲線讀取被測樣品中的MMP-9水平。

2 結果

2.1四組研究對象臨床資料的比較 四組研究對象性別和吸煙史的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中，肺癌組患者的年齡大于其他三組，肺結核組患者的BMI低于其他三組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2四組研究對象血清MMP-9水平的比較 對照組、肺結核組、肺炎組、肺癌組研究對象的血清MMP-9水平分別為(1 976.36±907.44)ng/ml、(4 350.45±2 574.75)ng/ml、(2 135.68±1 263.56)ng/ml和(2 590.38±1 532.84)ng/ml，差異有統(tǒng)計學意義(F=25.000，P<0.001)，其中，肺結核組患者的血清MMP-9水平顯著高于其他三組(P<0.001)，肺炎組患者與對照組或肺癌組研究對象的血清MMP-9水平差異無統(tǒng)計學意義(P=0.606、0.141)，肺癌組患者的血清MMP-9水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047)。

2.3不同臨床病理特征肺結核、肺癌患者的血清MMP-9水平的比較 不同痰培養(yǎng)結果、病變類型、病變范圍的肺結核患者及不同組織類型的肺癌患者的血清MMP-9水平的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而臨床分期較高、分化程度較低、發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的肺癌患者的血清MMP-9水平顯著高于臨床分期較低、分化程度較高、未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的肺癌患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、3。

2.4血清MMP-9在肺結核鑒別診斷中的價值分析 血清MMP-9在肺結核與健康人+肺炎+肺癌、健康人、肺炎、肺癌、肺炎+肺癌鑒別診斷中的AUC分別為0.739、0.769、0.751、0.699、0.725(P<0.05)。見表4、圖1。

表1四組研究對象臨床資料的比較

Tab.1Comparisonofclinicaldataamongfourgroupsinvolvedinthisstudy

Clinical dataTuberculosisgroup(n=60)Controlgroup(n=60)Pneumoniagroup(n=60)Lung cancergroup(n=60)F value/χ2 valueP valueAges (year)44.26±9.643)43.23±10.753)45.67±11.063)59.28±5.741)2)3)15.036<0.001Gender (male,%)28(46.67)30(50.00)29(48.33)26(43.33)0.5850.900BMI(kg/m2)22.36±3.322)3)4)24.17±4.231)24.06±4.141)23.84±3.711)6.7350.009Smoking history (case,%)19(31.67)17(28.33)19(31.67)20(33.33)0.3680.947

Note：vs the lung cancer groups,1)P<0.05;vs the control group,2)P<0.05;vs the pneumonia group，3)P<0.05;vs the lung cancer group,4)P<0.05.

Clinicopathological featuresnSera MMP-9 levelst valueP valueSputum Positive74 512.24±2713.620.3060.695Negative534 225.85±2281.21Pathology typesEmpty114 407.75±2839.520.1380.864Non-empty494 286.87±2572.23ScopeSingle leaf354 284.48±2059.560.5110.482Multiple leaf254 603.35±2781.15

表3不同臨床病理特征肺癌患者的血清MMP-9水平的比較

Tab.3ComparisonofseralevelsofMMP-9inpatientswithlungcancerwithdifferentclinicopathologicalfeatures

Clinicopathological features nSera MMP-9t valueP valueTissue typesNon-small cell lung cancer492 417.82±1 339.870.4490.563Small cell lung cancer112 628.19±1 672.53Clinical stagesⅠ-Ⅱ131 887.35±1 068.423.6890.001Ⅲ-Ⅳ473 927.06±1 904.89Degree of differentiation Poorly254 171.18±1 865.524.928<0.001Middle and high352 002.44±1 536.71Distant metastasisYes214 382.62±1 775.845.901<0.001No392 054.43±1 256.87

表4血清MMP-9在肺結核鑒別診斷中的價值

Tab.4DiagnosticvalueofseraMMP-9intuberculosis

Diagnostic typeAUCSE value95%CIP valueCutoff value(ng/ml)SensitivitySpecificityTuberculosis vs health+pneumonia+lung cancer0.7390.0440.653～0.826<0.0014127.830.5330.922Tuberculosis vs health0.7690.0470.677～0.860<0.0013524.380.6000.900Tuberculosis vs pneumonia0.7510.0460.661～0.840<0.0014284.640.5330.900Tuberculosis vs lung cancer0.6990.0490.604～0.794<0.0015008.970.4330.967Tuberculosis vs pneumonia + lung cancer0.7250.0450.637～0.813<0.0014273.390.5170.908

圖1 血清MMP-9在肺結核鑒別診斷中的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum MMP-9 in differential diagnosis of pulmonary tuberculosisNote: A.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis group in comparison of health control group,the pneumonia group and the lung cancer group；B.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis groups in comparison of the health control group；C.The ROC curve of serum MMP-9 in in diagnosis of the pulmonary tuberculosis groups in comparison of the pneumonia group；D.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis and the lung cancer group；E.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis and the pneumonia group,the lung cancer group.

3 討論

本研究顯示肺結核和肺癌患者血清MMP-9水平均顯著高于健康人群，肺結核患者的血清MMP-9水平要顯著高于肺癌患者。張錦萍[11]研究顯示，初治肺結核患者可出現(xiàn)血清MMP-9水平的顯著升高，尤其痰菌陽性、肺內(nèi)病變廣泛、肺內(nèi)病變有空洞患者的血清MMP-9水平較高，在接受抗結核治療后，患者的MMP-9水平會出現(xiàn)顯著下降，特別是轉(zhuǎn)陰患者的下降幅度更大，這提示了血清MMP-9水平的動態(tài)變化與肺結核患者的活動程度和病情轉(zhuǎn)歸密切相關。陳健兒等[12]研究顯示，在肺結核患者的肺部組織中，也存在著MMP-9的過表達，活動性肺結核患者肺組織中的MMP-9表達水平更高。袁國平等[13]的研究結果顯示，結核性腦膜炎患者腦脊液中的MMP-9水平要高于病毒性腦膜炎和非感染性神經(jīng)系統(tǒng)患者，而且在疾病急性期的水平要高于恢復期，這可用于鑒別診斷結核性腦膜炎。但關于MMP-9在肺結核鑒別診斷中的研究則不多，一些研究中報道了MMP-9在鑒別診斷結核性胸液、惡性胸液、漏出性胸液中具有一定的價值，但也有研究結果顯示，在肺癌患者的血清樣本和腫瘤組織中也可檢出MMP-9水平升高，其水平與肺癌的組織學分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移及TNM分期有關，并可在手術之后出現(xiàn)顯著下降[14-16]。這些研究結果提示了肺癌患者的血清MMP-9水平也可出現(xiàn)升高，這可能影響其在肺結核與肺癌鑒別診斷中的臨床價值，但從本研究結果可以看出，相對肺癌患者，肺結核患者的血清MMP-9水平升高更加劇烈，這能夠為臨床診斷提供參考依據(jù)。

本研究結果顯示，血清MMP-9在人群的肺結核篩查和肺結核與肺炎、肺癌的鑒別診斷中均可能具有一定的價值，其中，在人群的肺結核篩查中的價值最高，而在與肺癌的鑒別診斷中價值最低，但在Cutoff值下，血清MMP-9的診斷靈敏度偏低，而診斷特異度較高，因此，在應用時還需要結合其他臨床檢查和標志物檢測來提高靈敏度。近年來，關于MMP-9與肺結核發(fā)病的相關性機制研究較為缺乏，但針對其他慢性肺部疾病的研究卻在一定程度上揭示了MMP-9在肺部疾病持續(xù)性炎癥損傷中的作用。于嘉琛等[17]研究顯示，在慢性哮喘小鼠模型的支氣管上皮細胞中可出現(xiàn)MMP-9高表達，MMP-9表達增加與血清類黏蛋白1樣蛋白3(ORMDL3)基因的表達上調(diào)具有相關性，而二者的表達增高可能共同參與了氣道壁厚度等慢性哮喘氣道重塑進程。安鐘健等[18]的研究結果顯示，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)/血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)/MMP-9信號通路可能是誘導大鼠模型肺纖維化的重要通路之一。潘娜等[19]的研究結果顯示，MMP-9與慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)氣道炎癥的關系也十分緊密，MMP-9的過表達可能是導致COPD急性發(fā)作的重要原因之一?？挡试频萚20]的研究結果顯示，在COPD的發(fā)生和急性加重過程中，患者血清MMP-9水平的上升還與Th17細胞功能異常存在一定相關性，二者相互影響，加重COPD的自體免疫反應?？梢?，在多種慢性氣道及肺組織異構性疾病中，MMP-9表達水平的升高均發(fā)揮了促進炎癥損害、加劇免疫功能紊亂、誘導病情加重的作用。同時，國外研究針對MMP-9在其他部位結核發(fā)生和發(fā)展過程中的作用也進行了一定的報道，Ong等[21]的研究結果顯示中性粒細胞分泌的MMP-9造成了血腦屏障的核心成分IV型膠原的破壞，從而降低腦組織對病原菌的抵抗能力。Chen等[22]研究顯示，結核菌能夠激活ERK信號通路誘導TLR2、TNF-α的表達從而引起人體細胞MMP-9表達水平的升高，這一病理變化與積液和胸膜纖維化具有密切的相關性，很有可能促進了肺結核的發(fā)病和進展，這些研究結果都提示了結核菌可通過對人體細胞的入侵和分泌相關毒素來促進組織MMP-9的高表達，進而加劇病變局部及全身的免疫失衡和炎癥損害，監(jiān)測患者的血清MMP-9水平有助于輔助診斷結核菌的感染和損害。

綜上所述，肺結核患者表現(xiàn)為血清MMP-9水平的顯著升高，其升高幅度高于肺癌或肺炎患者，可作為一種血清標志物用于肺結核的鑒別診斷和篩查，但應注意適當提高診斷的靈敏度。