張春陽,祝 艷,馮華松
目前針對放射性肺損傷(RILI),仍缺少有效的治療手段。研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有減輕放射性肺損傷、肺纖維化的作用[1],且目前已開展臨床試驗研究探索[2],但具體的作用機(jī)制仍不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn),通過提高M(jìn)SCs上CXCR4基因的表達(dá)后,可增強其向受損傷組織部位的歸巢,提升治療效果[3]。前期研究中[4],筆者已證實通過慢病毒轉(zhuǎn)染,使來源于臍帶的MSCs過表達(dá)CXCR4基因后,MSCs的趨化、遷移能力提高。目前國內(nèi)尚無關(guān)于病毒轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs對RILI中細(xì)胞因子影響的報道。本研究通過觀察慢病毒轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs對參與放射性肺損傷的10 kDa干擾素γ誘導(dǎo)蛋白(IP-10)、轉(zhuǎn)化生長因子 β1(TGF-β1)、血小板源生長因子 (PDGF)、腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)-2的影響,探討轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs治療RILI可能的機(jī)制,為MSCs在臨床中的應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)。
1.1 實驗材料
1.1.1 細(xì)胞來源與準(zhǔn)備 新生兒臍帶來源于醫(yī)院婦產(chǎn)科,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),與產(chǎn)婦及家屬簽署知情同意書后,無菌條件下留取剖宮產(chǎn)的足月健康新生兒臍帶,經(jīng)組織塊法貼壁培養(yǎng)[5],實驗采用第3代細(xì)胞。MSCs已進(jìn)行多向分化和免疫表型鑒定[5]。通過慢病毒轉(zhuǎn)染第3代MSCs,治療組細(xì)胞采用攜帶 CXCR4和 EGFP的慢病毒載體(LV-CXCR4-EGFP),對照組細(xì)胞采用僅攜帶EGFP的慢病毒載體(LV-EGFP)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,具體方法見參考文獻(xiàn)[4]。
1.1.2 主要試劑及設(shè)備 CXCR4基因設(shè)定來源于人類,GENE ID為 7852,Genebank編號為 NM_001008540。CXCR4慢病毒載體,由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司協(xié)助構(gòu)建,載體為GV287,分子量為 10.4 kb,元件順序為:Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP,克隆位點為AgeI/AgeI。C57雌性小鼠,購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,動物合格證號:SCXK-(軍)2012-0004。DMEM/F12培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素(Hyclone公司,美國),胰蛋白酶(Trypsin)(Invitrogen 公司,美國),胎牛血清(FBS)(Gibco 公司,美國),羥脯胺酸(HYP)、丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(華美生物有限公司),PDGF、TGF-β1 ELISA 試劑盒(Abcam 公司,美國),TNF-α ELISA試劑盒(Abcam公司,美國)。熒光倒置顯微 鏡 (Olympus 公司,CKX-41,日本),酶標(biāo)儀(Thermo 公司,美國)。
1.2 實驗方法
1.2.1 構(gòu)建放射性肺損傷小鼠模型 將24只雌性出生后2個月左右的C57小鼠,隨機(jī)分為4組:正常組、照射組、對照組和治療組,每組各6只。照射組、對照組和治療組小鼠腹腔注射5%水合氯醛(每只0.006 ml/g)麻醉后,呈俯臥位固定鼠板上。調(diào)整直線加速器照射野,設(shè)定照射參數(shù)(13 Gy,6 MV,3.68 Gy/min),窗寬 20 cm×2.5 cm,源距 1 m,給予全肺一次性X線照射。照射之后,將小鼠放置動物房繼續(xù)飼養(yǎng)。
1.2.2 各組干預(yù)措施 對照組和治療組于放射線照射后第1 d,分別自小鼠尾靜脈注射LV-EGFP和LV-CXCR4-EGFP轉(zhuǎn)染后的MSCs,每只細(xì)胞數(shù)量5×105/0.2 ml。正常組和照射組,分別經(jīng)尾靜脈注射約0.2 ml的0.9%生理鹽水。
1.3 熒光顯微鏡觀察 放射線照射后的第7 d,處死小鼠后留取肺組織檢測。取小鼠右肺下葉肺組織標(biāo)本,進(jìn)行冰凍切片,厚度5 μm;用含DAPI的甘油封片劑封片,熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP標(biāo)記的MSCs在肺組織的分布情況。
1.4 病理組織學(xué)觀察 左肺下葉標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、切片,厚5 μm,行HE染色,光鏡下觀察病理組織學(xué)的變化。
1.5 ELISA檢測 取小鼠右肺上葉標(biāo)本,組織勻漿后,采用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測HYP、MDA、IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α 和 MMP-2 的含量。
1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),實驗數(shù)據(jù)以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 MSCs在肺組織中分布 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),對照組和治療組肺組織內(nèi)有綠色熒光表達(dá)的細(xì)胞,且治療組表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量多于對照組;而照射組肺組織內(nèi)未見明顯的綠色熒光表達(dá)(圖1)。
圖1 熒光顯微鏡檢測小鼠肺組織內(nèi)EGFP標(biāo)記的MSCs分布
2.2 病理組織學(xué)觀察 HE染色可見,正常組肺組織肺泡壁完整,肺間質(zhì)無增厚,無明顯的炎性細(xì)胞滲出、浸潤,結(jié)構(gòu)組織清晰(圖2a);照射組肺組織可見肺泡間隔增厚,伴有大量炎性細(xì)胞浸潤,部分肺泡腔逐漸變小,部分萎陷,肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞(圖2b);治療組和對照組肺組織內(nèi),亦可見局部肺泡間隔增厚,炎性細(xì)胞浸潤,但肺泡間隔增厚程度明顯較照射組減輕,肺泡組織結(jié)構(gòu)破壞也較照射組明顯減輕(圖 2c、d)。
圖2 小鼠肺組織病理組織學(xué)HE染色
2.3 ELISA檢測結(jié)果 與正常組比較,照射組肺組 織 內(nèi) HYP、MDA、IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α 和MMP-2表達(dá)明顯升高(P<0.01),而治療組和對照組較照射組明顯下降(P<0.01)。與對照組比較,除TNF外,治療組其他指標(biāo)下降的更加明顯(P<0.01)。見表1。
本研究發(fā)現(xiàn),治療組肺組織內(nèi)EGFP標(biāo)記的MSCs數(shù)量比對照組增多,提示轉(zhuǎn)染CXCR4后MSCs歸巢能力提高,與前期體外研究的結(jié)果相符合[4]。同時,組織病理學(xué)結(jié)果和反映組織氧化應(yīng)激損傷的MDA和纖維化程度的HYP含量檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs較對照組MSCs,更明顯地減輕放射線導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng),并減少HYP的升高,提示其具有更好的減輕RILI作用。
RILI發(fā)生、發(fā)展過程中,涉及多種細(xì)胞因子和靶細(xì)胞相互作用,有促進(jìn)和修復(fù)作用的細(xì)胞因子是影響 RILI發(fā)展趨勢的主要因素[6]。IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α和MMPs被認(rèn)為具有參與損傷、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)纖維化形成的作用[6]。IP-10是屬于CXC趨化因子家族的促炎細(xì)胞因子,在免疫系統(tǒng)不同的細(xì)胞系中起到誘導(dǎo)趨化性作用[7],被認(rèn)為參與介導(dǎo)RILI免疫反應(yīng)[6]。TGF-β1是致纖維化細(xì)胞因子,被認(rèn)為是放射性肺損傷重要的標(biāo)志物之一[8],給予輸注MSCs后,可降低RILI小鼠體內(nèi)TGF-β1的水平[9]。PDGF具有趨化炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的作用,使肺內(nèi)成纖維細(xì)胞分裂和增殖增加,促進(jìn)纖維化的形成[10]。TNF-α是促炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子[10],在RILI的發(fā)生和維持過程中具有重要作用。MSCs通過拮抗TNF-α阻斷纖維化信號通路[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12],肺纖維化早期階段,MMPs的水平升高,降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用增強,從而損傷肺組織。本研究發(fā)現(xiàn),上述細(xì)胞因子在放射線照射后小鼠肺組織內(nèi)表達(dá)均明顯升高,與文獻(xiàn)報道相一致。而在給予MSCs后,其表達(dá)水平均顯著下降,其中轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs相對于對照組,其抑制作用更加明顯,提示轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs具有更好的抑制放射線照射致細(xì)胞因子異常表達(dá)作用,從而減輕RILI。這有可能與提升MSCs趨化歸巢能力后,使進(jìn)入局部損傷組織的MSCs增多有關(guān),但不能排除局部由于過表達(dá)CXCR4后,影響了RILI組織內(nèi)其他的信號通路機(jī)制導(dǎo)致有關(guān),還需要進(jìn)一步研究明確。
表1 各組ELISA檢測結(jié)果比較(n=6)
綜上所述,通過輸注轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs可更好地減輕RILI,更有效地抑制參與RILI細(xì)胞因子的異常升高,為今后利用基因修飾的MSCs治療RILI提供有力的理論依據(jù)。