秦松林，劉婷，胡威，劉伯龍，唐正，馮聚玲，譚靖（.南華大學附屬第一醫(yī)院泌尿男科，湖南衡陽00；.南華大學附屬第一醫(yī)院手術(shù)中心，湖南衡陽00；3.南華大學醫(yī)學院診斷學教研室，湖南衡陽00；.中南大學湘雅三醫(yī)院泌尿外科，湖南長沙003）

腎細胞癌（RCC）是臨床上較為常見的惡性腫瘤之一，占腎臟腫瘤的 85％～90％[1?2]。腎臟不容易受創(chuàng)傷，但是當腎臟出現(xiàn)病變時也不容易被發(fā)現(xiàn)。另外，RCC在臨床癥狀上又缺乏特異性。近50％的RCC患者在早期是無任何臨床癥狀的，臨床上大部分患者通過體檢或檢查其他疾病時才被發(fā)現(xiàn)。

轉(zhuǎn)移性RCC采用以內(nèi)科治療為主的綜合性治療，但療效欠佳[3]。目前還缺乏特異性的腫瘤標志物來檢測RCC，所以早期預(yù)測RCC還有較大的困難。因此，篩選RCC發(fā)生及復發(fā)轉(zhuǎn)移的標志物，對早期發(fā)現(xiàn)RCC、有效防治RCC具有非常重要的意義。

細胞凋亡亦稱程序性細胞死亡，具有重要的病理生理意義。凋亡失調(diào)是許多疾病的發(fā)病機制之一，所以通過抑制細胞凋亡，可以防治這些疾病。目前，在所發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子中，存活素（Survivin）的功能最強大。其不但具有抑制細胞凋亡的功能，而且還有調(diào)節(jié)細胞增殖的作用。Survivin基因位于17q25染色體上，由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成，全長大約有14 700個堿基對。

研究表明，在人類胚胎發(fā)育的組織中和大多數(shù)的惡性腫瘤組織當中都有Survivin的表達，包括胃癌、膀胱癌等，而其在正常成熟組織中表達陰性，具有腫瘤特異性表達的特點[4]。目前，有關(guān)Survivin的研究已成為熱點。本實驗采用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）法從mRNA水平上檢測RCC組織和正常腎組織中Survivin的表達。本文探討Survivin與RCC的相關(guān)性，期待為早期發(fā)現(xiàn)RCC，并且為判斷RCC惡性程度提供新手段。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標本來源 在2010年3月至2011年9月中南大學湘雅三醫(yī)院泌尿外科收治的RCC患者中隨機挑選出63例，將其手術(shù)切除的RCC標本作為研究組，另取其相應(yīng)的遠離腫瘤組織的正常腎組織作為對照組，取自距離腫瘤組織5 cm以上。63例患者中男36例，女27例；年齡28～75歲，平均（54.0±8.3）歲。所有患者均行 RCC 根治術(shù)，術(shù)后病理證實均為RCC。臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ、Ⅳ期35例[參照《2011版中國泌尿外科疾病診斷治療指南》中推薦采用的2002年美國腫瘤研究聯(lián)合委員會（ATCC）腎癌臨床分期方法]；病理分級：高分化30例，中分化21例，低分化12例[參照《2011版中國泌尿外科疾病診斷治療指南》中推薦采用的2004年世界衛(wèi)生組織（WHO）病理分級方法]。將最終實驗結(jié)果與RCC各臨床病例參數(shù)的關(guān)系進行統(tǒng)計學分析。

1.1.2 主要試劑及儀器 PCR引物（英韋創(chuàng)津生物公司，廣州，中國），DNA Marker，RevertAidTM First Strand cDNA 合成試劑盒（Fermentas，Maryland，USA）；PCR熱循環(huán)儀、低溫微量離心機（Eppendorf，Hamberg，Germany）。

1.2 方法 采用熒光定量PCR，提取2組RCC組織和癌旁正常組織總RNA，并用DNA酶Ⅰ處理后進行定量分析，2組取等量的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進行熒光定量PCR檢測。具體程序如下：預(yù)變性95℃，30 s，20℃，1個循環(huán)；PCR 反應(yīng) 95℃，5 s，20℃，60℃，34 s，20℃，40個循環(huán)，72℃，34 s，20℃，40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學處理 以人胚腎細胞系HEK293為參照細胞系，β?actin 作為內(nèi)參基因，根據(jù)通用的 2?△△CT方法，Survivin△CT∕β?actin△CT 計算樣本中 Survivin 的相對表達量。應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組RCC組織和正常腎組織中Survivin mRNA表達情況比較 研究組RCC組織中Survivin mRNA高表達陽性51例（80.95％）。對照組正常腎組織中未發(fā)現(xiàn)Survivin mRNA高表達陽性。Survivin mRNA在研究組RCC中的陽性表達率明顯高于對照組正常腎組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表 1。

表1 2組RCC組織和正常腎組織中Survivin mRNA表達情況比較

2.2 不同臨床分期RCC中Survivin mRNA表達情況比較 Survivin mRNA在Ⅲ、Ⅳ期RCC中陽性表達率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期RCC，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床分期RCC中Survivin mRNA表達情況比較

2.3 不同病理分級RCC中Survivin mRNA表達情況比較 Survivin mRNA在低、中分化RCC中陽性表達率明顯高于高分化RCC，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同病理分級RCC中Survivin mRNA表達情況比較

2.4 Survivin mRNA在RCC中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 Survivin mRNA在35例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的RCC中陽性表達30例（85.71％），在28例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的RCC中陽性表達15例（53.57％）。Survivin mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的RCC中陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 RCC，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 4。

表4 Survivin mRNA在RCC中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

3 討 論

篩選RCC發(fā)生及復發(fā)轉(zhuǎn)移的標志物對早期發(fā)現(xiàn)RCC，進而早期診治RCC具有非常重要的意義。在已知多種癌前病變中，均有Survivin的表達。包括結(jié)腸息肉、乳腺腺瘤、博文氏病、肥厚性光化性角化病[5]。

王克文等[6]使用熒光定量PCR法檢測38例食管癌中 Survivin mRNA的表達情況。結(jié)果顯示，Survivin mRNA陽性表達率為73.68％，且與腫瘤惡性程度有關(guān)，而與食管鱗癌患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著性關(guān)系。在惡性黑色素瘤的基因表達上，有許多角色參與調(diào)控其細胞增殖、DNA修復。作為凋亡相關(guān)基因，Survivin在惡性黑色素瘤細胞質(zhì)與細胞核中均可以被檢測出，而在良性或發(fā)育不良痣上無表達[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin的核表達可以預(yù)測惡性黑色素瘤的復發(fā)[8]。Sur?vivin表達與膀胱腫瘤的臨床分期、病理分級有著密切關(guān)系，并且是早期復發(fā)的重要預(yù)測因子。李守賓等[9]用免疫組織化學檢測了45例前列腺惡性腫瘤組織和50例良性前列腺組織中Survivin的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在45例前列腺癌組織中，共有37例表達陽性，陽性率為82.2％；在50例良性前列腺組織中，僅有6例表達陽性。其中在前列腺癌組織中，Survivin的陽性表達率及表達強度與Gleason評分呈正相關(guān)，即在Gleason低分化組中的表達顯著低于高分化組。WANG等[10]應(yīng)用免疫組織化學方法檢測24例RCC組織中的Survivin水平，結(jié)果顯示Survivin的表達與腫瘤的惡性程度、分級、分期、淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

本研究采用熒光定量PCR法檢測腎組織中的Sur?vivin mRNA水平表達，結(jié)果顯示，63例RCC組織中Survivin mRNA高表達陽性為51例（80.95％），正常組織未發(fā)現(xiàn)mRNA陽性表達。本研究通過mRNA水平證實了Survivin在RCC中的高表達，在正常腎組織中不表達。通過本研究結(jié)果可以看出，Survivin只選擇性高表達于RCC組織中，而在正常腎組織中的表達為陰性。在RCC的發(fā)展與演變過程中，Survivin可能起到了舉足輕重的作用。

進一步研究Survivin的表達與RCC的關(guān)系，Sur?vivin mRNA在中、低分化RCC表達陽性率均顯著高于高分化RCC。Survivin mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的RCC中高表達陽性。這表明Survivin的表達與RCC的惡性程度有密切關(guān)系，可能參與了RCC的臨床進展。

Survivin是RCC一個獨立危險因素，與RCC的復發(fā)、預(yù)后密切相關(guān)。在RCC的各個時期均能夠檢測出Survivin的陽性表達，可以認為Survivin可能在RCC發(fā)生早期中起作用，在胰腺癌、結(jié)腸癌中同樣有類似的研究 [11?12]。

綜上所述，Survivin有望成為判斷RCC轉(zhuǎn)移和預(yù)后等生物學行為的重要指標，將有可能成為腫瘤治療的新靶點。