陳 茜， 王 容， 項國劍， 李 泱， 林風輝， 張建成

心臟實現(xiàn)泵血功能是以心肌的收縮和舒張為基礎的，心臟之所以能不停地進行有序的、協(xié)調的收縮與舒張交替的活動，歸根結底都是由心肌細胞動作電位(action potential, AP)的規(guī)律性發(fā)生與擴布引起的。竇房結是心臟正常竇性節(jié)律的起搏點，竇房結細胞具有強大的自律性，可以自發(fā)、有節(jié)律地搏動。心臟的正常搏動由竇房結組織產生，并按傳導組織的順序依次通過結間束抵達房室結及心房肌，后通過希氏束、浦肯野纖維使全部心室肌幾乎同時被激動，從而引起心肌細胞有節(jié)律地收縮和舒張。

已知心肌細胞主要由4類細胞組成，包括心室肌細胞(ventricular cell, VC)、心房肌細胞(atrial cell, AC)、竇房結細胞(sino-atrial node cell, SNC)[包括移行細胞(T-細胞)和起搏細胞(P-細胞)]和浦肯野纖維。前二者是工作細胞，具有穩(wěn)定的靜息電位，主要執(zhí)行收縮功能，在4相的靜息期無自動去極化功能。而竇房結細胞是自律性細胞，它們組成心內特殊傳導系統(tǒng)，這類細胞大多沒有穩(wěn)定的靜息電位，在4相的最大舒張期可以發(fā)生緩慢自動去極化，并可自動產生節(jié)律性興奮。目前，乳鼠和成年大鼠心肌細胞被用于藥物干預、缺氧復氧損傷、疾病模型離子通道改變等方面的研究，但成年大鼠心肌細胞分離后無法傳代和長時間培養(yǎng)，只能用于即時及短時間研究，限制了干預[1-3]，而乳鼠心肌細胞由分離培養(yǎng)后獲得，數(shù)量多，對乳鼠心肌細胞膜AP的認識有利于今后進行模型構建、藥物干預等較長時間的研究。為此，本研究采用全細胞膜片鉗技術，觀察乳鼠竇房結細胞、心房肌細胞及心室肌細胞的AP，并進行比較。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 新生24 h內Wistar大鼠15只，清潔級，雌雄不拘，SPF級[斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK(京)2011-0004]，質量檢測單位：中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2試劑與溶液 DMEM細胞培養(yǎng)基、PBS磷酸鹽緩沖液(美國Thermo公司)；FBS胎牛血清(美國Invitrogen公司)；HEPES緩沖液(美國Amresco公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；Trypsin(中國Hotaibio公司)；NaCl，KCl，NaHCO3，MgCl2·6H2O，Na2ATP，K-aspartate，CaCl2，Na2ATP及葡萄糖(美國Sigma公司)。

記錄單細胞AP的細胞外液(mmol/L)配方：NaCl 140，KCl 4，MgCl2·6H2O 1.0，HEPES 10，Glucose 5，CaCl21.0；pH值用NaOH調至7.36。記錄單細胞AP的電極內液(mmol/L)配方：K-aspartate 120，KCl 20，MgCl2·6H2O 1.0，Na2ATP 4，HEPES 10，Glucose 10；pH值用KOH調至7.30。

1.2方法

1.2.1乳鼠心肌細胞的急性分離與培養(yǎng)方法 (1)取材：乳鼠體表用75%酒精反復浸泡數(shù)秒后，呈仰臥位固定四肢于泡沫上，消毒胸腹部皮膚，沿胸骨右緣剪開并去除前胸壁，暴露心臟，置于解剖顯微鏡下分離心包膜，將心臟向右下方輕輕牽拉，輕移右心耳，看清上腔靜脈，于界嵴中部靜脈竇側、前腔靜脈根部取0.7 mm×0.7 mm×0.7 mm的組織塊，同時剪取心房組織及心室中下1/3處，立即置于預冷的不含血清的DMEM培養(yǎng)液；(2)沖洗：將組織培養(yǎng)皿置于超凈臺中，用滴管反復輕柔吹打組織，洗去部分殘留血液后，再次將組織塊移入PBS液中反復吹打沖洗，直至洗凈；(3)消化：將清洗后的組織塊移入消毒過的青霉素小瓶內，用眼科剪將組織塊剪碎成0.5～1.0 mm3的乳糜狀小塊，加入體積為組織塊30～50倍的0.08%的胰酶，用吸管輕柔吹打0.5 min，自然沉淀后棄上清液。再加入0.08%的胰酶(體積同上)，置于37 ℃水浴中輕輕振蕩3～5 min，吹打0.5 min，自然沉淀，吸取上清液，加入等體積的10% FBS培養(yǎng)基終止消化，重復消化3～5次，至基本消化成單細胞為止；(4)過濾、離心：將細胞懸液用400目金屬濾網過濾后分裝于15 mL的離心管中離心，940 r/min下離心6 min，棄上清液；(5)接種培養(yǎng)：每根15 mL離心管用含10% FBS培養(yǎng)基重懸后，將單細胞懸液接種于60 mm的培養(yǎng)皿內，置于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2孵箱中孵育90 min；(6)采用差速貼壁法分離技術，因成纖維細胞貼壁快，培養(yǎng)皿中的細胞懸液即為較純化的心肌細胞，輕輕吸出培養(yǎng)皿內的細胞懸液，分裝于6個35 mm的培養(yǎng)皿內，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，每天換液1次，以備膜片鉗記錄用。

1.2.2膜片鉗記錄方法及刺激參數(shù)的設置 選取細胞膜完整、表面光滑、橫紋清晰的心肌細胞檢測AP。采用全細胞膜片鉗記錄的方法，將膜片鉗放大器(Axonpatch 700B，美國Axon公司)與計算機連接，應用數(shù)模轉換器(Digidata 1440A，美國Axon公司)采集刺激信號及電壓輸入信號，此過程由Clampfit-9.2軟件控制調節(jié)。GG-17玻璃毛坯經微電極拉制儀(pp-83，日本Narishige公司)經兩步法拉制成電阻為3.0～5.0 MΩ的微電極，常規(guī)安裝電極并調整方向，調節(jié)三維微操縱器，使微電極頭端進入細胞外液，在顯微鏡下觀察電極的位置，緩慢移動，使其與細胞膜進行封接，電極電阻上升0.5～1 MΩ時停止移動，通過注射器給電極施加負壓，使封接電阻達1 GΩ或以上，吸破細胞膜成為全細胞記錄模式，信號經截止頻率為1 kHz的四階貝塞爾低通濾波器，采樣頻率為5 kHz。將膜片鉗設定為電流鉗模式，記錄竇房結細胞AP時不給予刺激，記錄心房肌及心室肌細胞膜AP時給予2.5 ms、1 000 pA、1.0 Hz的外向電流，誘導并記錄心室肌單細胞AP。

2 結 果

2.1竇房結細胞、心房肌細胞及心室肌細胞分離培養(yǎng)后的生長狀況 于倒置顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)后的細胞：接種培養(yǎng)后，視野下見大小不等、圓形、清亮的單細胞懸浮于培養(yǎng)基中，4 h后，3種細胞均開始貼壁生長，16 h后可見部分散在細胞開始搏動；48 h后各類細胞胞體不斷增大，搏動的細胞漸增多，偶可見融合成片狀的細胞同步搏動。培養(yǎng)24 h后，可見竇房結細胞體積小，細而長，呈長梭形(圖1A)，心房肌細胞體積亦較小，呈梭形或三角形(圖1B)，而心室肌細胞體積較大，可伸出偽足并交織成網，呈短梭形、多角形或不規(guī)則形(圖1C)。

A：竇房結細胞(×100)； B：心房肌細胞(×100)；C：心室肌細胞(×40).圖1 倒置顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)后的細胞Fig 1 Observation of cells isolated and cultured under inverted microscope

2.2竇房結細胞、心房肌細胞及心室肌細胞培養(yǎng)后搏動頻率比較 隨機選取竇房結細胞、心房肌細胞和心室肌細胞各10個計算搏動頻率，3種細胞的搏動頻率分別為(152.1±10.9)，(116.3±8.6)，(92.4±9.3)min-1，組間兩兩比較，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2)。

VC：心室肌細胞；AC：心房肌細胞；SNC：竇房結細胞.圖2 竇房結細胞、心房肌細胞及心室肌細胞搏動頻率比較Fig 2 Comparison of beating rates in sino-atrial node cells, atrial cells and ventricular cells

2.3竇房結細胞、心房肌細胞、心室肌細胞膜AP 在膜片鉗實驗電流鉗模式下記錄3種細胞的AP，在不給予任何電流的刺激下，竇房結細胞可記錄到自發(fā)性AP(圖3A)，給予2.5 ms、1 000 pA、1 Hz的電流刺激后，可誘發(fā)出心房肌和心室肌細胞AP(圖3B，3C)。心房肌細胞AP形狀呈三角形，而心室肌細胞的AP形狀則更像矩形。

A：竇房結細胞； B：心房肌細胞； C：心室肌細胞.圖3 竇房結細胞、心房肌細胞及心室肌細胞動作電位Fig 3 Action potential of sino-atrial node cells, atrial cells and ventricular cells

2.4竇房結細胞最大舒張電位(maximum depolarization potential, MDP)及心房肌細胞、心室肌細胞膜AP靜息電位(resting membrane potential, RMP)的比較 竇房結細胞沒有穩(wěn)定的靜息電位，其MDP為(-41.3±4.0)mV(n=16)，而心房肌細胞、心室肌細胞的RMP分別為(-50.7±2.9)mV(n=11)，(-59.8±2.1)mV(n=13)，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4)。

VC：心室肌細胞；AC：心房肌細胞；SNC：竇房結細胞.圖4 竇房結細胞最大舒張電位、心房肌細胞及心室肌細胞膜動作電位靜息電位的比較Fig 4 Comparison of MDP in sino-atrial node cells and RMP in atrial cells and ventricular cells

2.5竇房結細胞、心房肌細胞、心室肌細胞膜AP時程(action potential duration, APD)的比較 竇房結細胞、心房肌細胞、心室肌細胞復極至20%(APD20)分別為(23.6±4.9)，(11.6±2.2)及(23.8±6.8)ms，復極至50%(APD50)分別為(77.82±5.1)，(93.9±13.0)及(206.9±21.0)ms，復極至90%(APD90)分別為(208.2±10.8)，(211.1±17.5)及(386.4±33.3)ms。心室肌細胞的APD20，APD50和APD90均較心房肌細胞延長，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5)。

3 討 論

AP的產生主要是細胞膜兩側電荷的不均衡分布以及細胞膜對某些離子的通透性發(fā)生改變所致。不同心肌細胞具有不同種類和特性的離子通道，因而不同部位的心肌細胞AP的開關機制及其電生理特性也不盡相同。

本研究結果顯示，竇房結細胞無需電流刺激可記錄出自發(fā)性AP，其搏動頻率較心房肌細胞及心室肌細胞快。因竇房結細胞屬于自律性細胞，其AP分為0相去極化期，3相復極化期和4相舒張期，與心房肌細胞及心室肌細胞等工作心肌AP的最大不同是，其去極化期存在眾多離子參與的內向和外向電流。由于其細胞膜上很少表達瞬時外向鉀電流(Ito)通道和缺乏內向整流鉀電流(IK1)通道，因此竇房結細胞AP無明顯的1相和2相，而是直接進入3相復極化過程；同時，因L型鈣電流(ICa,L)和T型鈣電流(ICa,T)的激活、延遲整流鉀電流(IK)的失活、起搏電流(If)的發(fā)展，故竇房結細胞可自動去極化而產生自發(fā)性AP[4-6]。

APD:動作電位時程； VC：心室肌細胞；AC：心房肌細胞；SNC：竇房結細胞. 與AC比較，☆：P<0.05.圖5 竇房結細胞、心房肌細胞、心室肌細胞動作電位APD20，APD50，APD90的比較Fig 5 Comparison of APD20, APD50, APD90 in sino-atrial node cells, atrial cells and ventricular cells

一般情況下，心肌細胞均可記錄到靜息電位和AP，而在AP中又包括去極化和復極化兩大過程。工作心肌的靜息電位中，由內向整流鉀電流(IK1)引起的K+平衡電位是構成靜息電位的主要成分，同時心肌細胞膜在靜息狀態(tài)下對Na+也有一定通透性，由鈉泵活動產生的泵電流可以使細胞內的負電位稍增大[7]。本實驗結果得出，心房肌及細胞靜息電位較心室肌細胞小，但差別無統(tǒng)計學意義，考慮心房肌細胞靜息電位受到Na+內漏的影響較大，且其細胞膜上IK1通道密度較心室肌細胞低，故其細胞內負電位與心室肌細胞相比較小。有文獻報道，乳鼠心房肌及心室肌細胞靜息電位分別為-60～-70 mV，-70～-80 mV[8-9]。但本實驗記錄到的心房肌及心室肌細胞靜息電位較低，考慮可能與膜片鉗試驗中細胞封接不夠嚴密和破膜不夠完全有關。

工作心肌的AP通常分為5個時相：0～4相。0相為AP起始階段的除極反應，是由鈉離子通道(INa)開放和Na+內流所引起；1～4相構成了AP的復極過程，Na+，K+，Ca2+及Na+/K+泵等電流共同參與其中[7]。比較心房肌和心室肌細胞的APD時，心房肌細胞平臺期不明顯，且APD時程較心室肌短。因心房肌細胞存在各種鉀離子電流，如Ito及IK，細胞膜對K+的通透性較大，K+外流和復極化速度較快，同時還有心室肌細胞不存在的超激活的延遲整流鉀電流(IKur)和持續(xù)外向鉀電流(Iso)，且其ICa,L較弱，可能是心房肌細胞AP呈三角形、APD較短、特別是APD20和APD50更短的原因[1,10-13]。此外，心房肌細胞的Ito通道較發(fā)達，加速其復極化過程，故其平臺期不明顯。而心室肌細胞中ICa,L密度大，故其AP具有明顯的2相平臺期。心室肌上IK是AP快速復極期的主要電流，主要有快激活的延遲整流鉀電流(IKr)和慢激活的延遲整流鉀電流(IKs)，而哺乳動物的心房肌上該電流不明顯[6,14]，故心室肌細胞APD90較心房肌細胞長。

本實驗未對竇房結細胞、心房肌細胞及心室肌細胞的各種離子流進行研究，因乳鼠為剛出生的大鼠，發(fā)育尚不完全，參與AP各時相的離子通道是否與成年大鼠有差異尚不明確，還需在今后實驗中進一步完善與探討，為今后進行缺氧復氧損傷、疾病模型離子通道及藥物干預等方面的研究奠定堅實的電生理基礎。