葉明皓，胡秀彩，呂愛(ài)軍，孫敬鋒，劉小雪，宋亞嬌

(1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院,天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

雷氏普羅威登斯菌屬于腸桿菌科Enterobacteriaceae、普羅威登斯菌屬Providencia[1]。研究表明，人類(lèi)感染雷氏普羅威登斯菌可引發(fā)腹瀉、肺炎、尿道炎等多種疾病[2-3]。近年來(lái)，雷氏普羅威登斯菌可導(dǎo)致魚(yú)、蝦、鱉等多種水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病死亡[4-6]。Faisal等[4]從瀕死尼羅羅非魚(yú)Oreochromisniloticus體內(nèi)分離得到雷氏普羅威登斯菌。Bejarano等[5]從瀕死鰱Hypophthalmichthysmolitrix心臟、腎臟等組織分離獲得雷氏普羅威登斯菌。戰(zhàn)文斌等[6]從患敗血病對(duì)蝦Fenneropenaeuschinensis體內(nèi)分離出雷氏普羅威登斯菌。范紅結(jié)等[7]從患病中華鱉Trionyxsinensis肝、脾和肺等實(shí)質(zhì)器官均分離鑒定到雷氏普羅威登斯菌。李林俐等[8]對(duì)發(fā)病與死亡揚(yáng)子鱷Alligatorsinensis進(jìn)行病原學(xué)分離研究，鑒定病原菌為雷氏普羅威登斯菌。但是，關(guān)于雷氏普羅威登斯菌感染龜鱉類(lèi)動(dòng)物導(dǎo)致眼炎病例，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

近年來(lái)，由于養(yǎng)殖水環(huán)境污染加劇，龜類(lèi)細(xì)菌性疾病頻繁發(fā)生，往往造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9-13]。楊瑞婷[13]報(bào)道，巴西龜眼炎主要表現(xiàn)為眼瞼發(fā)炎充血，后逐漸變成灰白色且腫大，眼角膜和鼻黏膜糜爛，嚴(yán)重時(shí)雙目失明，呼吸受阻等。最近，天津市某寵物龜養(yǎng)殖場(chǎng)的巴西龜發(fā)病，主要表現(xiàn)為眼睛發(fā)炎充血、腫大，精神沉郁、行動(dòng)緩慢，攝食減少或停止攝食等臨床癥狀，初步診斷為細(xì)菌性眼炎病例。本研究中，從發(fā)病龜眼內(nèi)黏液中分離獲得1株細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA測(cè)序、生理生化特性、藥敏試驗(yàn)、回歸感染試驗(yàn)及病理學(xué)觀察等系統(tǒng)研究，旨在為研究巴西龜眼炎的病原及其致病機(jī)理等提供數(shù)據(jù)資料，為該病的防治提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康巴西龜購(gòu)自天津水產(chǎn)市場(chǎng)(體質(zhì)量約8.0 g)，在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)觀察2周，確認(rèn)健康無(wú)病后用于后續(xù)試驗(yàn)。發(fā)病巴西龜(體質(zhì)量約150.0 g)為天津市某寵物龜養(yǎng)殖場(chǎng)的送檢病龜。

細(xì)菌生化鑒定管和藥敏紙片均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司，PCR Master Mix試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，膠回收DNA提取試劑盒(離心柱型)購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與純化 參照蘭云等[9]的試驗(yàn)方法，將發(fā)病巴西龜體表病灶用無(wú)菌生理鹽水沖洗，無(wú)菌操作取患病龜眼部組織及其分泌液劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫下培養(yǎng)18 h。挑取優(yōu)勢(shì)單菌落接種純化，經(jīng)過(guò)3次純化后得到純菌種，置于冰箱(4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌生理生化試驗(yàn) 將分離純化后的菌株28 ℃下培養(yǎng)18 h，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。將菌株無(wú)菌操作接種于細(xì)菌生化鑒定管中，進(jìn)行硝酸鹽還原、半固體動(dòng)力、糖(醇、苷)類(lèi)代謝等48種生理生化特性測(cè)定，具體方法參照文獻(xiàn)[14-15]。

1.2.3 細(xì)菌基因組DNA提取及16S rDNA基因序列擴(kuò)增 將分離菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)過(guò)夜，取2 mL培養(yǎng)液于離心管中，4 ℃下以12 000 r/min離心2 min，棄去上清液；加500 μL超純水，漩渦振蕩30 s，置95 ℃下水浴5 min；再于4 ℃下以12 000 r/min離心2 min，取350 mL上清液為DNA模板，保存于-20 ℃中備用。

細(xì)菌的16S rDNA測(cè)序采用通用引物27F:5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′，1492R:5′ GGTTACCTTGTTACGACTT 3′，引物來(lái)自生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL):2×TaqPCR Master Mix 10L，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，無(wú)菌雙蒸水11 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因，并將PCR產(chǎn)物送天津金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。用膠回收試劑盒回收純化16S rDNA目的條帶，與pMD18-T載體連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，采用引物M13-47:5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′，RV-M:5′ GAGCGGATAACAATTTC- ACACAGG 3′進(jìn)行菌落PCR陽(yáng)性克隆篩選，隨機(jī)取陽(yáng)性克隆送天津金唯智生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 細(xì)菌16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析 將16S rDNA序列通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，同時(shí)在NCBI下載已公布的普羅威登斯菌屬細(xì)菌16S rDNA基因序列進(jìn)行相似性比較，采用MEGA 5.2軟件用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并通過(guò)1000次的自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測(cè)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行29種常用抗生素藥物的敏感性檢測(cè)，將分離菌株均勻涂布于LB平板上，依次貼上藥敏紙片，28 ℃下培養(yǎng)18 h后，測(cè)量抑菌圈直徑，測(cè)量3次取其平均值，以抑菌圈直徑大小作為判定細(xì)菌對(duì)藥物敏感性的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6 動(dòng)物感染試驗(yàn) 隨機(jī)選取20只健康巴西龜作為試驗(yàn)動(dòng)物，感染組龜10只采取人工腹腔注射含菌量為1.88×108cfu/mL菌液，注射量為0.1 mL/只，對(duì)照組龜10只注射相同劑量的0.1 mL無(wú)菌生理鹽水；飼養(yǎng)溫度約為20 ℃，連續(xù)觀察21 d，記錄發(fā)病死亡情況。參照李玉平等[12]的方法對(duì)試驗(yàn)龜進(jìn)行組織病理觀察，無(wú)菌操作取正常和發(fā)病死亡巴西龜眼瞼等組織放入波恩氏液中固定，用常規(guī)石蠟切片、H.E染色，觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴西龜眼炎病原菌的分離及理化特性

巴西龜發(fā)病主要表現(xiàn)為眼睛發(fā)炎充血、腫大，行動(dòng)遲緩，攝食減少等臨床癥狀，初步診斷為細(xì)菌性眼炎，從發(fā)病龜眼內(nèi)分泌液中分離獲得1株革蘭氏陰性細(xì)菌，編號(hào)為G0503菌株。該菌在LB培養(yǎng)基28 ℃下培養(yǎng)18 h，菌落形態(tài)呈圓形、邊緣整齊、透明濕潤(rùn)，直徑為1.0～1.5 mm，該分離菌經(jīng)染色鏡檢顯示為革蘭氏染色陰性短桿狀細(xì)菌。細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株與半乳糖、甘露醇、肌醇、甘露糖等反應(yīng)為陽(yáng)性，與賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等反應(yīng)為陰性，根據(jù)該菌株的形態(tài)學(xué)和理化特性，基本符合普羅威登斯菌屬Providencia細(xì)菌的生理生化特征(表1)。

表1 菌株G0503的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the strain G0503

注：+ 表示陽(yáng)性;-表示陰性;F表示發(fā)酵型

Note： +,positive; -,negative；F,fermentative type

2.2 分離菌的16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

以分離菌 株G0503基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA序列，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)出大小約為1500 bp的目的條帶(圖1泳道1、2)，PCR產(chǎn)物測(cè)序獲得16S rDNA片段大小為1386 bp；進(jìn)一步將其亞克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中后篩選陽(yáng)性克隆(圖1泳道3、4、5)，測(cè)得16S rDNA長(zhǎng)度為1500 bp (GenBank登錄號(hào)：MG138153)。Blast比對(duì)結(jié)果表明，與模式菌株P(guān)rovidenciarettgeriDSM 4542(AM040492.1)的16S rDNA序列一致性均為99.30%，與Providenciarettgeri(JN644501.1)的16S rDNA序列一致性為99.60%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示,分離菌株G0503與Providenciarettgeri(JN644501.1)親緣關(guān)系最近，自然聚為一支(圖2)，最終判定G0503菌株為雷氏普羅威登斯菌。

注：M為DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1、2為16S rDNA，3、4、5為陽(yáng)性克隆Note: M,DNA standard DL 2000; 1 and 2, 16S rDNA, 3, 4 and 5, positive clones圖1 菌株G0503的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增及陽(yáng)性克隆檢測(cè)Fig.1 PCR amplification and detection of 16S rDNA positive clone in the strain G0503

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的菌株G0503系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain G0503 based on gene sequence of 16S rDNA

2.3 分離菌G0503的藥敏特性

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：G0503菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢哌酮、諾氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考、阿米卡星、美羅培南、亞胺培南等抗生素高度敏感；對(duì)頭孢克肟、鏈霉素、慶大霉素、新霉素等抗生素中度敏感；對(duì)阿莫西林、氨芐西林、頭孢氨芐、卡那霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑、甲氧嘧啶、萘啶酸、依諾沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、阿奇霉素、萬(wàn)古霉素、克林霉素、利福平、呋喃唑酮、呋喃妥因等耐藥。

用G0503菌株人工腹腔注射健康巴西龜感染6 d后，試驗(yàn)龜出現(xiàn)發(fā)病、死亡現(xiàn)象，21 d累積死亡率達(dá)40%(4/10)，感染龜主要臨床癥狀為眼睛腫大、發(fā)炎充血、眼分泌液增多(圖3)，精神沉郁，行動(dòng)遲緩，攝食減少或停止攝食，偶有前肢抓撓眼部等現(xiàn)象。人工感染發(fā)病死亡巴西龜與自然發(fā)病癥狀基本相同，并且從病死龜體內(nèi)分離到與G0503菌株特征一致的細(xì)菌。注射生理鹽水的對(duì)照組龜，觀察21 d無(wú)發(fā)病死亡現(xiàn)象。進(jìn)一步進(jìn)行組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，病龜眼瞼組織上皮細(xì)胞中的多邊形細(xì)胞消失，出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、色素細(xì)胞增多等病變(圖4-A)，而對(duì)照組正常巴西龜眼瞼組織染色見(jiàn)圖4-B。

3 討論

3.1 雷氏普羅威登斯菌的致病性

普羅威登斯菌廣泛分布于土壤、水體等自然環(huán)境中[16]。雷氏普羅威登斯菌不僅影響?hù)~(yú)、蝦、龜鱉、鱷等水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖[6，8，17]，而且對(duì)人類(lèi)飲食構(gòu)成潛在危害[3,17]。目前，有學(xué)者研究認(rèn)為，雷氏普羅威登斯菌是條件致病菌，作為一種“人-獸-魚(yú)”共患病病原菌，主要導(dǎo)致心包炎、腹瀉、腹水等癥狀[18-19]。Zhang等[20]研究報(bào)道，雷氏普羅威登斯菌自然感染蠶導(dǎo)致敗血癥。最近，國(guó)內(nèi)學(xué)者從豬內(nèi)臟器官、糞便樣品中分離得到雷氏普羅威登斯菌[3,15]，并且證實(shí)對(duì)小鼠有較強(qiáng)致病性。也有報(bào)道雷氏普羅威登斯菌污染引起人食物中毒現(xiàn)象[21]。

注： A為眼睛腫大; B為黏液增多Note: A,eyes are swollen; B, increased mucus圖3 發(fā)病巴西龜癥狀Fig.3 Symptom of the turtle Trachemys scriptaelegans

注： A為患病巴西龜; B為健康巴西龜Note:A,diseased turtle; B,healthy turtle圖4 巴西龜眼瞼組織病理染色結(jié)果Fig.4 Pathological observation of turtle Trachemys scriptaelegans with ophthalmia

近幾年，關(guān)于雷氏普羅威登斯菌引發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物疾病等相關(guān)研究較受關(guān)注[3-8]。王建峰等[22]從國(guó)外船舶壓艙水中分離出雷氏普羅威登菌。Faisal等[4]等報(bào)道羅非魚(yú)發(fā)生大量死亡，病魚(yú)鰓發(fā)白、腫脹，嚴(yán)重腹水，并在病死魚(yú)的心、腎和脾中分離得到雷氏普羅威登斯菌。戰(zhàn)文斌等[6]在發(fā)病的中國(guó)對(duì)蝦淋巴液中分離出雷氏普羅威登斯菌，認(rèn)為該菌是對(duì)蝦細(xì)菌性敗血癥的病原。Bejarano等[5]研究表明，雷氏普羅威登斯菌是人工養(yǎng)殖鰱大量死亡的主要原因。陳永林等[23]從海洋館病死白鰭鯊Triaenodonobesus腹腔膿液、心血中分離到一株致病性雷氏普羅威登斯菌。李林俐等[8]報(bào)道揚(yáng)子鱷發(fā)病死亡，從其肝臟和血液中分離出雷氏普羅威登斯菌。范紅結(jié)等[7]從患病中華鱉肝、脾和肺中分離出相同的病原菌，經(jīng)鑒定為雷氏普羅威登斯菌，主要表現(xiàn)為鱉底板出血，肺、脾等內(nèi)臟干酪樣結(jié)節(jié)等臨床癥狀。本試驗(yàn)中，從發(fā)病巴西龜眼部分泌液中分離到一株雷氏普羅威登斯菌G0503菌株，進(jìn)行了細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，人工感染巴西龜主要呈現(xiàn)眼睛發(fā)炎腫大、反應(yīng)呆滯、攝食減少或停止攝食等臨床癥狀，組織染色觀察發(fā)現(xiàn)，病龜出現(xiàn)眼瞼組織上皮細(xì)胞中的多邊形細(xì)胞消失，色素細(xì)胞增多等病理變化。

3.2 雷氏普羅威登斯菌的藥敏特性

由于抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖和疾病防控中的廣泛應(yīng)用，且濫用藥物現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，從而使魚(yú)類(lèi)疾病防治面臨著新的挑戰(zhàn)與難題[6,8]。夏淑等[24]研究報(bào)道，人類(lèi)雷氏普羅威登斯菌對(duì)喹諾酮類(lèi)、β內(nèi)酰胺類(lèi)及碳青霉烯類(lèi)等抗生素耐藥。戰(zhàn)文斌等[6]研究表明，蝦源雷氏普羅威登斯菌對(duì)羧芐青霉素、頭孢唑啉、復(fù)方新諾明、鏈霉素等藥物敏感，但對(duì)新生霉素和紅霉素等耐藥。陳永林等[23]對(duì)白鰭鯊雷氏普羅威登斯菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示其對(duì)頭孢曲松、頭孢哌酮和諾氟沙星等抗生素敏感。李林俐等[8]對(duì)揚(yáng)子鱷雷氏普羅威登斯菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示其對(duì)頭孢噻肟、頭孢哌酮、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺異惡唑和復(fù)方新諾明等多種抗生素敏感。由此可見(jiàn)，人源雷氏普羅威登斯菌對(duì)喹諾酮類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)等藥敏特性與水產(chǎn)動(dòng)物源雷氏普羅威登斯菌存在明顯差異，這可能與菌株來(lái)源、地域分布和臨床用藥有關(guān)[8,24]。本研究中，對(duì)龜源雷氏普羅威登斯菌G0503菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌對(duì)頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、諾氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考等藥物敏感，對(duì)阿莫西林、氨芐西林、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明等耐藥。研究表明，水產(chǎn)動(dòng)物雷氏普羅威登斯菌對(duì)頭孢菌素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)及氟苯尼考等抗生素敏感[6,8]，這與本試驗(yàn)中巴西龜雷氏普羅威登斯菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本一致。以上研究報(bào)道了雷氏普羅威登斯菌藥敏特性，可為水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治提供參考依據(jù)。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究中從患病巴西龜眼內(nèi)分離到1株雷氏普羅威登斯菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)頭孢克肟、頭孢哌酮、頭孢噻肟、諾氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考等藥物敏感；人工回歸感染證實(shí)，該菌對(duì)巴西龜有致死性，并且導(dǎo)致眼瞼等組織病理變化。本研究結(jié)果不僅為龜類(lèi)細(xì)菌性疾病防治提供科學(xué)依據(jù)，而且對(duì)雷氏普羅威登斯菌感染龜鱉類(lèi)水生動(dòng)物的致病機(jī)理研究進(jìn)行了有益的探索。