胡增祥 杜昱蕾 劉全喜 王媛 李亮

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近年肺癌的發(fā)病率和死亡率都有明顯的增高趨勢[1]。氧化應激反應與肺癌的發(fā)生相關。由于多環(huán)芳烴會產生活性氧，以及代謝成毒性中間體，可以通過檢測過氧化氫酶（catalase, CAT）活性以反映氧化應激相關的信號。丙二醛（malondialdehyde, MDA）是脂質過氧化物的代謝產物。P38MAPK是MAPK家族的重要成員之一，在、應激狀態(tài)下，與炎癥反應及細胞凋亡關系密切。已有文獻報道了蛇毒[2,3]、蜂毒[4,5]和蝎毒[6]的抗腫瘤作用。目前尚無關于雷氏大疣蛛蜘蛛毒素對人肺癌細胞A549的作用的報道。因此，本研究旨在通過檢測雷氏大疣蛛蜘蛛毒素對人肺癌A549細胞增殖、CAT、MDA及P38MAPK表達的影響，為探討大疣蛛蜘蛛毒素對人肺癌細胞A549的作用機理，有助于探究雷氏疣蛛蜘蛛毒素的抗腫瘤效應，為其是否有可能成為治療肺癌的新的多肽類藥物提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 通過電刺激法采集純的雷氏大疣蛛雷氏大疣蛛蜘蛛毒素。使用前將雷氏大疣蛛蜘蛛毒素凍干并置于-80oC環(huán)境中。將雷氏大疣蛛蜘蛛毒素溶于緩沖溶液PBS中并離心（1 000 g, 10 min），去除不溶物質。臨時配制不同實驗的試驗溶液，通過用DMEM稀釋原液將毒素調整至最終濃度為0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL。PBS用作陰性對照。DDP購自Sigma有限公司。

人肺腺癌細胞A549來源于美國ATCC（American Type Culture Collection）。用含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基，其內加入2 mmol/L的谷氨酰胺+0.05 mmol/L 2-巰基乙醇（2ME）+10%胎牛血清。保持細胞濃度為2×105/mL-9×105/mL，在37oC、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)。甘油作為其冷凍保護劑。2.5 g/L胰酶消化傳代。實驗時取對數(shù)生長期細胞。首先將細胞在10%FCS中培養(yǎng)2天。然后每2天通過離心、洗滌6次且傳代的方式收集細胞。

將處理過的雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用到A549細胞。在處理和控制細胞培養(yǎng)24 h后，再將其收獲進行分析。本實驗中的所有數(shù)據(jù)至少出自3次獨立的實驗，均顯示出同樣的表達模式。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測雷氏大疣蛛蜘蛛毒素的細胞毒性 細胞增殖抑制實驗通過MTT法[8]檢測。將A549細胞種在96孔板中，100 mL培養(yǎng)基中1×104個細胞。24 h后，用200 mL PBS取代96孔板中的培養(yǎng)基并且加入不同濃度的雷氏大疣蛛蜘蛛毒素（8 μg/mL, 16 μg/mL, 32 μg/mL），DDP作為陽性對照和PBS作為陰性對照。細胞在37oC環(huán)境下培養(yǎng)48 h。每個孔加入50 mL的MTT溶液。培養(yǎng)4 h后，樣品溶于二甲基亞砜（DMSO）中，并用酶標儀檢測樣品吸光度，測定波長492 nm，參考波長690 nm。OD值表示出試驗組和對照組的光密度。 重復實驗3次。采用線性分析確定IC50值。

1.2.2 CAT活性的檢測 以過氧化氫為底物，用紫外分光光度法測定其被CAT降解量，間接計算CAT活力。過氧化氫酶降解率（240 nm測量）用來檢測雷氏大疣蛛蜘蛛毒素處理細胞和對照組細胞的過氧化氫酶活性的變化[9]。

1.2.3 MDA含量的檢測 脂質過氧化水平，通過MDA含量來檢測，用硫代巴比妥酸（TBA）方法[10,11]。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 A549細胞調整為5×105/mL的細胞濃度。孵育48 h后，用雷氏大疣蛛蜘蛛毒素處理的細胞與未經雷氏大疣蛛蜘蛛毒素處理的細胞進行平行對照。細胞用70%乙醇收集并懸浮，4oC，1 h。用胰蛋白酶進行收集并用PBS液沖洗3次。將懸浮顆粒置于250 mL PBS和100 mL Annexin V/PI溶液中。在避光室溫情況下碘化染色30 min，細胞懸浮液通過流式細胞儀（BD公司，美國）進行檢測。測定細胞周期，觀察G1期、G2期、S期各期細胞所占的百分比，觀察是否存在凋亡峰。通過WinMDI 2.5版本軟件（TSRI流式細胞術）來分析。

1.2.5 Western blot檢測P38MAPK的表達[12]通過緩沖液裂解制備A549全細胞裂解液，緩沖液中含有1%Nonidet P-40、乙磺酸50 mmol/L（pH7.5）、氯化鈉100 mmol/L，EDTA 2 mmol/L、焦磷酸緩沖液1 mmol/L、原釩酸鈉10 mmol /L、苯甲基磺酰氟1 mmol/L以及氟化鈉100 mmol/L。相同濃度的裂解液與十二烷基硫酸鈉反應-10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用轉移緩沖液（Tris 25 mmol/L，甘氨酸192 mmol/L，甲醇10%[v/v]）將其轉移到PVDF膜上。PVDF膜用Tris緩沖液（TBS: Tris 0.5 mol/L pH7.6, Nacl 0.15 mol/L）沖洗，并用TBS-5%牛血清白蛋白（BSA）在室溫下過夜，含有抗體的TBS-5%BSA孵育。ECL化學發(fā)光試劑盒（Kirkegaard & Perry Labo-ratories）顯色進行檢測P38MAPK的表達。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，3次獨立實驗的數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素抑制A549細胞增殖 通過細胞生長曲線的回歸方程算出24 h雷氏大疣蛛蜘蛛毒素對A549細胞的IC50為12 μg/mL。隨著濃度范圍從8 μg/mL到32 μg/mL，抑瘤率（growth inhibitory rate, GIR）呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性（圖1）。

2.2 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素對A549細胞中CAT活性和MAD含量的影響 在雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用的細胞中檢測到CAT活性和MDA的形成增加（圖2，圖3），但無濃度依賴性（P＞0.05）?？梢?，雷氏大疣蛛蜘蛛毒素參與氧化應激可能是通過增加CAT活性和MAD含量，從而引起對A549細胞的毒性作用。

2.3 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素誘導的G2/M期細胞周期阻滯 如圖4中所示，細胞周期在48 h周期中連續(xù)進行。隨著雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用時間的延長，與陰性對照組相比，細胞的G1期細胞比例明顯減少，S期細胞減少，G2期細胞明顯增加，細胞阻滯在G2/M期。

2.4 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素對A549細胞中P38MAPK蛋白表達的影響 由圖5可見，隨著雷氏大疣蛛蜘蛛毒素濃度的增加，A549細胞中P38MAPK蛋白表達逐漸降低?？梢?，雷氏大疣蛛蜘蛛毒素抑制A549細胞增殖可能與P38MAPK激酶表達含量降低有關。

圖 1 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素抑制A549細胞增殖Fig 1 The inhibition of A549 cells proliferation by spider venom

圖 2 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素增加A549細胞CAT活性Fig 2 Spider venom increased activity of CAT in A549 cell

圖 3 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素增加A549細胞MAD含量Fig 3 Spider venom increased MAD content in A549 cell

圖 5 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素減少A549細胞中P38MAPK蛋白表達Fig 5 Spider venom reduced expression of P38MAPK in A549 cells

圖 4 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素誘導的G2/M期細胞周期阻滯。A：雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用A549細胞前；B：雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用A549細胞后。Fig 4 The cell cycle distribution of A549 cells by the spider venom. A: before treated by the spider venom； B: after treated by the spider venom.

3 討論

中國是一個肺癌高發(fā)的危險區(qū)。原發(fā)性肺癌治療仍然困難，依賴于基礎醫(yī)學研究成果。最近的研究[13,14]結果表明，細胞凋亡和周期的改變與腫瘤的發(fā)生、進展和轉移密切相關。

本研究結果表明，在A549細胞經雷氏大疣蛛蜘蛛毒素24 h作用后，濃度依賴性誘導凋亡。通過MTT法測定雷氏大疣蛛蜘蛛毒素在0 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL和32 μg/mL劑量時顯著抑制了A549細胞增殖。在雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用的細胞中檢測到CAT活性和MDA的形成增加，但無濃度依賴性。隨著雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用時間的延長，對細胞生長的抑制作用可能是由于G2/M期細胞周期的阻滯，并出現(xiàn)一明顯的凋亡峰。雷氏大疣蛛蜘蛛毒素可能通過抑制P38MAPK的表達發(fā)揮其誘導凋亡作用。據(jù)報道MAPK激酶特別是P38蛋白激酶在雙向調節(jié)細胞周期和細胞凋亡的途徑上發(fā)揮重要作用[15]。P38MAPK激酶對細胞周期調控和細胞凋亡的影響符合這些結論[16]。P38MAPK蛋白表達的改變也顯示了經雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用后的細胞周期調節(jié)表達的模式，意味著雷氏大疣蛛蜘蛛毒素有可能作為一個化學預防藥物對肺癌進行治療和預防。

令人感興趣的是，P38MAPK表達的減少是由雷氏大疣蛛蜘蛛毒素引起的，但是整個細胞周期的上下游各種蛋白的協(xié)調和結合尚未被完全檢測。因此，其詳盡機理有待在今后的細胞周期調控中繼續(xù)探索。