李穎 劉紅雨 王競(jìng) 李永文 吳蘅 杜欣欣 王偉強(qiáng) 岳蛟 周清華 陳軍

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過(guò)程，在基因水平上明確惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展并尋求治療手段，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。其中，腫瘤細(xì)胞凋亡障礙及其機(jī)制受到了許多研究者的關(guān)注。BAG基因（Bcl-2-associated athanogene）家族是近年發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因家族，其分泌蛋白是已經(jīng)被確認(rèn)的多功能結(jié)合蛋白，可與Bcl-2和熱休克蛋白70（heat shock proteins 70, Hsc70/Hsp70）結(jié)合，并可以與一系列轉(zhuǎn)錄因子作用調(diào)節(jié)各種生理過(guò)程?，F(xiàn)有的研究表明，BAG家族成員的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)病及預(yù)后相關(guān)。本研究采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)BAG家族基因在29例肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá)，并通過(guò)兩組GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，探討B(tài)AG家族基因表達(dá)與肺腺癌易感性的關(guān)系，為肺癌的發(fā)病及預(yù)后判斷等提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本及驗(yàn)證數(shù)據(jù) 本研究29例患者的肺腺癌組織和距癌組織5 cm外遠(yuǎn)癌組織配對(duì)標(biāo)本來(lái)源于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺外科手術(shù)切除標(biāo)本。其中男性18例，女性11例；年齡最大者75歲，最小者51歲，平均年齡（62.14±6.48）歲；組織標(biāo)本符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①患者臨床診斷均為I期-IV期（PTNM）原發(fā)性肺癌；②術(shù)前均未進(jìn)行化療和放療；③手術(shù)切除組織立即置入液氮中低溫冷凍保存。

驗(yàn)證數(shù)據(jù)為美國(guó)國(guó)立生物信息中心（NCBI）GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載的分別由Li-Jen Su和Landi MT等提交的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE7670和GSE10072。GSE7670數(shù)據(jù)為27例中國(guó)臺(tái)灣省肺腺癌患者，其中男性5例，女性22例；GSE10072數(shù)據(jù)為33例美國(guó)肺腺癌患者，其中男性22例，女性11例；共120張配對(duì)的芯片掃描圖像文件。

1.1.2 基因芯片 本實(shí)驗(yàn)基因表達(dá)譜芯片采用美國(guó)Affymetrix公司提供的人類基因組HG-U133Plus-2.0芯片，該芯片涵蓋了大約54 000個(gè)人類基因序列。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE7670和GSE10072均采用Affymetrix公司HG-U133A芯片，此芯片涵蓋大約22 300個(gè)人類基因序列。

1.2 方法

1.2.1 cRNA的獲取及芯片雜交 按照Invitrogen公司操作按明書(shū)應(yīng)用Trizol方法抽提肺腺癌及癌旁組織的總RNA，紫外分析和變性膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量及濃度，用RNeasy Midi Kit（Qiagen）純化。按照Affymetrix one-cycle cDNA合成試劑盒實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)（2006）進(jìn)行cDNA合成純化，以IVT試劑盒進(jìn)行cRNA合成純化，之后cRNA片段化，經(jīng)瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)對(duì)片段化的cRNA質(zhì)控后，進(jìn)行探針標(biāo)記及芯片雜交和洗脫，利用Affymetrix公司7G掃描儀進(jìn)行芯片熒光掃描。以GCOS（gene-chip operation software）軟件收集所得數(shù)據(jù)。

1.2.2 GEO數(shù)據(jù)庫(kù) GSE7670和GSE10072按照Affymetrix表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)（2001）對(duì)癌及癌旁組織進(jìn)行總RNA抽提純化，cDNA合成純化，cRNA合成純化，cRNA片段化質(zhì)控，探針標(biāo)記及芯片雜交和洗脫，利用Affymetrix公司6G掃描儀進(jìn)行芯片熒光掃描。

1.2.3 結(jié)果分析 通過(guò)Bio-conductor軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)58張和驗(yàn)證數(shù)據(jù)120張Affymetrix配對(duì)的芯片掃描圖像文件進(jìn)行分析及標(biāo)準(zhǔn)化，得到定量及定性信號(hào)值，將有效值成組輸入統(tǒng)計(jì)軟件庫(kù)中進(jìn)行Cox回歸擬合單因素條件Logistic回歸分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，信號(hào)值數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，經(jīng)檢驗(yàn)每組信號(hào)值均呈正態(tài)性分布，采用配對(duì)t檢驗(yàn)法，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并用Cox回歸擬合單因素條件Logistic回歸，以BAG家族各基因的比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）表示相對(duì)危險(xiǎn)度。P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR＜1為保護(hù)因素，OR ＞1為危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1 29例本院肺腺癌患者癌組織及癌旁組織中BAG家族基因的表達(dá)及其與肺癌易感性的關(guān)系（表1） BAG家族基因中BAG-1（探針202387_at、211475_s_at、229720_at）、BAG-2（探針209406_at）、BAG-5（探針202985_s_at、230427_s_at）基因?yàn)榉蜗侔┮赘行缘谋Ｗo(hù)因素（P＜0.05, OR＜1），且BAG-1在正常肺組織中的表達(dá)顯著高于癌組織（P＜0.05），正常肺組織中BAG-2、BAG-5的表達(dá)略高于癌組織；BAG-4（探針222909_s_at、228189_at）基因?yàn)榉蜗侔┮赘行缘奈ｋU(xiǎn)因素（P＜0.05,OR＞1）且在癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肺組織（P＜0.05）；BAG-3（探針217911_s_at）基因表達(dá)與肺腺癌易感性的關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)29例肺腺癌患者癌組織BAG家族基因表達(dá)水平與性別和年齡分別做卡方檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BAG家族各基因表達(dá)與肺腺癌患者的性別和年齡的關(guān)系均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表 1 BAG家族基因表達(dá)與29例肺腺癌的關(guān)系Tab 1 Relationship between the expression of BAG family genes and 29 patients of lung adenocarcinoma

2.2 GSE7670數(shù)據(jù)庫(kù)（表2） 27例中國(guó)臺(tái)灣肺腺癌患者癌組織及癌旁組織表達(dá)譜芯片統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：BAG家族基因中BAG-1（探針202387_at、211475_s_at）、BAG-5（探針202984_s_at、202985_s_at）基因?yàn)榉蜗侔┮赘行缘谋Ｗo(hù)因素（P＜0.05, OR＜1）且在正常肺組織中的表達(dá)顯著高于癌組織（P＜0.05），與本研究結(jié)果一致；BAG-2（探針209406_at）、BAG-3（217911_s_at）、BAG-4（探針219624_at）基因表達(dá)與肺腺癌易感性的關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表 2 BAG家族基因表達(dá)與27例肺腺癌的關(guān)系Tab 2 Relationship between the expression of BAG family genes and 27 patients of lung adenocarcinoma

2.3 GSE10072數(shù)據(jù)庫(kù)（表3） 33例美國(guó)肺腺癌患者癌組織及癌旁組織表達(dá)譜芯片統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：BAG家族基因中BAG-1（探針202387_at、211475_s_at）基因?yàn)榉蜗侔┮赘行缘谋Ｗo(hù)因素（P＜0.05, OR＜1）且在正常肺組織中的表達(dá)顯著高于癌組織（P＜0.05），與本研究結(jié)果一致；BAG-2（探針209406_at）、BAG-3（217911_s_at）、BAG-4（探針219624_at）、BAG-5（探針202984_s_at、202985_s_at）基因表達(dá)與肺腺癌易感性的關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表 3 BAG家族基因表達(dá)與33例肺腺癌的關(guān)系Tab 3 Relationship between the expression of BAG family genes and 33 patients of lung adenocarcinoma

3 討論

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的BAG家族基因成員包括BAG-1、BAG-2、BAG-3、BAG-4、BAG-5、BAG-6，這些多功能結(jié)合蛋白也被稱為分子伴侶蛋白，通過(guò)其保守的BAG結(jié)構(gòu)域與熱休克蛋白70（heat shock proteins 70, Hsc70/Hsp70）的ATP酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，調(diào)節(jié)這些伴侶蛋白的功能，參與包括細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)分化、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞周期等各種生理過(guò)程。BAG家族基因可以正性調(diào)節(jié)也可以負(fù)性調(diào)節(jié)Hsc70/Hsp70的功能。Hsc70/Hsp70的ATP酶結(jié)構(gòu)域與BAG基因結(jié)合，它們的底物結(jié)合區(qū)依然可以結(jié)合底物蛋白（如c-Fos、Bcl-2等），BAG基因的許多功能如抑制凋亡、對(duì)核激素受體的作用以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄等都依賴于Hsc70/Hsp70對(duì)其他蛋白的調(diào)節(jié)作用，這些功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展和預(yù)后中起著重要作用。

近年研究中除了BAG-1以外，其他BAG家族成員在肺癌中的表達(dá)也少有報(bào)道。一般認(rèn)為BAG-1在腫瘤細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)與其臨床預(yù)后相關(guān)。一些研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞漿中BAG-1的過(guò)表達(dá)降低了腫瘤患者死亡危險(xiǎn)性，并可以作為臨床良好預(yù)后指標(biāo)?，F(xiàn)有的研究[1,2]表明，BAG-1在乳腺癌、肺癌和宮頸癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)，且BAG-1的高表達(dá)與腫瘤患者的臨床預(yù)后有關(guān)，但是過(guò)表達(dá)的BAG-1在細(xì)胞中的分布與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系還有爭(zhēng)議。Tang等[2]報(bào)道，在140例乳腺癌中，77.7%的乳腺癌BAG-1呈高表達(dá)，且BAG-1的高表達(dá)與患者的預(yù)后不良相關(guān)。但在肺癌的研究中，BAG-1的高表達(dá)卻與患者的良好預(yù)后相關(guān)[1]。我們的研究卻表明，在非小細(xì)胞肺癌中，BAG-1的表達(dá)與患者的預(yù)后不良相關(guān)，BAG-1低表達(dá)組患者生存期明顯長(zhǎng)于高表達(dá)組患者[3]。研究結(jié)果的差異可能與選用病例的疾病分期及組織學(xué)類型不同有關(guān)。BAG家族其他成員因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)較晚，對(duì)其功能的研究還不多見(jiàn)。但是，由于它們都具有相同的結(jié)構(gòu)域和相似的結(jié)構(gòu)，都通過(guò)BAG結(jié)構(gòu)域與Hsc70/Hsp70等發(fā)生作用，故推測(cè)它們也參與了肺癌的發(fā)生和發(fā)展。

本研究通過(guò)對(duì)29例肺腺癌患者的癌組織及癌旁組織BAG家族基因表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BAG-1、BAG-2、BAG-5為肺腺癌發(fā)生的保護(hù)性因素，并在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了部分驗(yàn)證。Turner等[4]發(fā)現(xiàn)122例浸潤(rùn)性乳腺癌組織與正常乳腺組織比較，其中79例BAG-1表達(dá)上調(diào)，在早期乳腺癌細(xì)胞漿中BAG-1的高表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和患者生存期呈負(fù)相關(guān)，提示BAG-1表達(dá)的改變可能是早期乳腺癌的一個(gè)征兆。其分子機(jī)制尚不明確，可能是BAG家族其他成員蛋白與BAG-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HSC70/HSP70有關(guān)，所以BAG-1基因與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

本研究中BAG-2、BAG-5亦為肺腺癌發(fā)生的保護(hù)因素，Wang等[5]在對(duì)甲狀腺癌中BAG-2的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)BAG-2表現(xiàn)促凋亡作用，且其促凋亡活性可能為蛋白酶體抑制劑所誘導(dǎo)。BAG-5除了可與Hsc70/Hsp70結(jié)合以外，其功能報(bào)道甚少。然而，最近的一項(xiàng)研究表明，BAG-5在帕金森氏病中發(fā)揮著重要作用。研究人員[6]發(fā)現(xiàn)BAG-5可抑制E3類酶和Hsc70/Hsp70的活性，促進(jìn)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞變性、凋亡，所以BAG-5可能會(huì)在帕金森氏病靶向治療中起到重要作用。這可能與BAG-2、BAG-5抑制腫瘤發(fā)生有一定的關(guān)系。另外，本研究結(jié)果與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果并不完全一致，有可能與人種、生存環(huán)境的差異較大有關(guān)。

Liao等[7]和Ozawa等[8]利用原位雜交和免疫組織化學(xué)方法對(duì)胰腺癌患者組織標(biāo)本和胰腺癌細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BAG-3和BAG-4均有過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，然而正常胰腺組織中呈低表達(dá)，結(jié)果顯示，BAG-3和BAG-4抑制凋亡作用可能與腫瘤的侵襲生長(zhǎng)有關(guān)。這與本研究中BAG-4表現(xiàn)為肺腺癌的危險(xiǎn)因素的結(jié)果相一致。BAG-4的功能與TNF-R1和死亡受體-3（DR-3）的胞漿部分有關(guān)。最近的數(shù)據(jù)[9]顯示TNF-R1的死亡域N末端含有一個(gè)ATP酶結(jié)構(gòu)域，ATP在BAG-4和TNF-R1之間起著調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)在體外Hsc70/Hsp70濃度的增加打斷了BAG-4和TNF-R1的連接，這表明Hsc70/Hsp70與TNF-R1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合BAG-4。正常生理狀態(tài)下，BAG-4與TNF-R1結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞受到TNF-α刺激時(shí)，BAG-4與TNF-R1解離，TNF-R1活化，繼而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。因此，BAG-4通過(guò)與TNF-R1結(jié)合發(fā)揮抗凋亡蛋白的功能，阻止配體非依賴性寡聚化和受體的活化。在多種癌細(xì)胞系中，BAG-4的過(guò)表達(dá)抑制了TNF-R1誘導(dǎo)的NF-κB的活化和細(xì)胞死亡[8,10]。近年也有研究[11]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞漿中BAG-4的高表達(dá)與上皮性卵巢癌的侵襲浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)。在宮頸癌Hela細(xì)胞中BAG-3表現(xiàn)出與Caspases和蛋白酶體相關(guān)的抗腫瘤凋亡活性[12]。

綜上所述，BAG家族基因所表達(dá)蛋白能夠通過(guò)其結(jié)構(gòu)域與其他蛋白作用，并通過(guò)增加目標(biāo)蛋白的分子伴侶發(fā)揮銜接分子的作用，進(jìn)而改變這些目標(biāo)蛋白的功能，其可能參與了包括蛋白降解、細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等在內(nèi)的多種細(xì)胞生理活動(dòng)。而很多研究者對(duì)BAG家族基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)位置及表達(dá)量與其在腫瘤發(fā)生中的作用還存在不同的觀點(diǎn)，BAG家族基因的作用還有待進(jìn)一步研究，探討其潛在的臨床意義，BAG家族基因有望作為癌癥早期診斷、判斷預(yù)后、個(gè)體化治療以及靶向治療的靶分子。