鐘華 韓寶惠

化學(xué)療法作為肺癌常規(guī)治療的中堅(jiān)力量，其目的是最大限度的殺傷腫瘤，但由于化療藥物對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有一定程度的殺傷或抑制效應(yīng)，因而普遍認(rèn)為化療抑制了機(jī)體的免疫功能。但是新近的研究發(fā)現(xiàn)，某些化療藥物可以通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞釋放諸如熱休克蛋白，鈣結(jié)合蛋白等內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，以及抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells, Treg）等機(jī)制介導(dǎo)抗腫瘤免疫，對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)有獨(dú)特的貢獻(xiàn)[1,2]；本文研究抗微管的化療藥物—紫杉醇對(duì)小鼠肺部腫瘤治療過程中獨(dú)特的增強(qiáng)免疫原性的機(jī)制；在已有的研究[3]中，發(fā)現(xiàn)紫杉醇5×10-8mol/L的濃度刺激抗原遞呈細(xì)胞的功能成熟；在本研究中，進(jìn)一步應(yīng)用此濃度的紫杉醇探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)體（transporters associated with antigen processing, TAP）的表達(dá)影響和對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI-1640，小牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；重組鼠源性GM-CSF、IL-4為Peprotech公司產(chǎn)品；抗鼠FITC-CD11b、PE-CD11b、APC-B220、FITC-CD4、PEFoxP3由Biolegend公司提供；流式一抗：FITC-MB1、FITC-Deta、FITC-Calreticulin、FITC-TAP1、FITC-TAP2、FITC-β2microglobulin由Biotechnologies公司提供；流式二抗由DAKO公司提供；小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株（3LL）為中科院細(xì)胞研究所提供；雄性C57BL/6小鼠由上海市腫瘤研究所提供；紫杉醇由美國施貴寶公司提供。

1.2 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面TAP-1和TAP-2表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)分兩組，一組為3LL 細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)中，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中；5 d后消化貼壁的腫瘤細(xì)胞；另一組細(xì)胞在5 d貼壁生長(zhǎng)后，加入終濃度為5×10-8mol/L的紫杉醇；48 h后收集細(xì)胞；兩組細(xì)胞分別分成細(xì)胞懸液7管，每管含單細(xì)胞懸液2×106個(gè)-5×106個(gè)，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗滌兩次，含2%多聚甲醛的PBS室溫下固定20 min，洗滌后，懸浮于含0.5%的PBS液，轉(zhuǎn)移至玻璃小管中，微波處理（200瓦）直至液體沸騰，立即轉(zhuǎn)入冰上冷凍，含1%BSA的PBS洗滌一次；將含1%BSA和0.1%皂角苷的PBS滲透樣品30 min，分別加入同型對(duì)照，流式一抗： FITC-TAP1、FITC-TAP2；室溫下30 min；含1%BSA和0.1%皂角苷的PBS洗滌兩次，加入羊抗鼠的流式二抗，室溫下30 min；含1%BSA和0.1%皂角苷的PBS洗滌兩次后，含1%BSA的PBS再洗滌一次，0.5%多聚甲醛固定，檢測(cè)；本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 小鼠尾靜脈接種腫瘤細(xì)胞 3LL腫瘤細(xì)胞0.3×106個(gè)，懸浮于500 μL PBS液中，從小鼠尾靜脈中注入；接種后隨機(jī)將小鼠分入腫瘤組和化療組；設(shè)立空白對(duì)照組。

1.4 化療藥物的注射 3LL腫瘤細(xì)胞小鼠尾靜脈接種后8 d，化療組小鼠腹腔內(nèi)接種紫杉醇，0.012 5 mg/只，懸浮于500 μL PBS溶液中；腫瘤組小鼠腹腔內(nèi)注射500 μL PBS溶液；21 d后取化療組，腫瘤組，空白對(duì)照組小鼠的肺部組織；本組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 小鼠肺部組織單細(xì)胞懸液的獲得 將DNA酶、膠原酶和透明質(zhì)酸酶混合，取4.5 mL上述的混合酶。取出肺部組織，眼科手術(shù)剪將小鼠肺部剪碎，置于混合酶中，37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min取出。研磨，應(yīng)用孔徑為75 μmol/L的細(xì)胞過濾器過濾獲得小鼠的肺部組織單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為1×106/mL。

1.6 Treg細(xì)胞的流式分析 上述的細(xì)胞懸液用FACS緩沖液洗滌，洗滌后加入FoxP3固定液，室溫下避光孵育20 min，染色緩沖液洗滌后再用FoxP3緩沖液洗滌一次，懸浮細(xì)胞于FoxP3緩沖液中，室溫避光15 min，洗滌后，分成5管，每管細(xì)胞為1×106個(gè)，分別加入同型對(duì)照，F(xiàn)ITC-CD11b、PE-CD11b、APC-B220、APC-B220+FITCCD4+PE-FoxP3各20 μL， 室溫避光30 min，染色緩沖液洗滌2次，上機(jī)分析；數(shù)據(jù)檢測(cè)應(yīng)用winMDI 2.8軟件分析；二維點(diǎn)陣圖勾勒CD25、CD4雙陽性細(xì)胞，在其中確認(rèn)FoxP3的細(xì)胞，即為Treg細(xì)胞的比例；

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件分析，配對(duì)t檢驗(yàn)和方差分析；所測(cè)數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞表面TAP表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)紫杉醇5×10-8mol/L處理的3LL細(xì)胞表面TAP1的表達(dá)（5.68%±0.65%）顯著高于3LL細(xì)胞組（1.93%±0.25%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）。經(jīng)紫杉醇5×10-8mol/L處理的3LL細(xì)胞表面TAP2的表達(dá)（89.54%±4.8%）顯著高于3LL細(xì)胞組（67.78%±5.08%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.036）（表1）。

2.2 流式分析定義Treg細(xì)胞 典型的流式分析Treg細(xì)胞見圖1；根據(jù)前向散射儀（FSC）和側(cè)向散射儀（SSC）的參數(shù)勾勒所需分析的細(xì)胞，定義為R1（圖1A）；在R1細(xì)胞群中勾勒CD25和CD4雙陽性的細(xì)胞，定義為R2（圖1B）；在R2細(xì)胞群中分析陽性表達(dá)FoxP3的細(xì)胞，即為Treg細(xì)胞（圖1C）。

2.3 肺部腫瘤局部Treg細(xì)胞的表達(dá) 圖2為各組代表性的Treg細(xì)胞，圖中右上象限的綠色細(xì)胞即為CD25+CD4+FoxP3+的Treg細(xì)胞。圖2A為正常對(duì)照組小鼠肺部的Treg細(xì)胞；圖2B為生理鹽水治療的小鼠，其肺部腫瘤細(xì)胞中Treg細(xì)胞的表達(dá)；圖2C為經(jīng)紫杉醇治療后的小鼠，其肺癌局部Treg細(xì)胞；荷瘤小鼠肺部腫瘤中Treg細(xì)胞的表達(dá)（25.46%±2.23%）明顯高于正常對(duì)照組的小鼠（12.46%±1.21%）（P＜0.001）；紫杉醇化療組小鼠肺部腫瘤組織中Treg細(xì)胞的表達(dá)為17.53%±1.24%，明顯低于腫瘤組（25.46%±2.23%）（P=0.004）（表2）。

表 1 各組小鼠肺腺癌細(xì)胞中TAP-1和TAP-2的表達(dá)Tab 1 The expression of TAP-1 and TAP-2 in each group

圖 1 流式分析Treg細(xì)胞。根據(jù)前向散射儀（FSC）和側(cè)向散射儀（SSC）的參數(shù)勾勒所需分析的細(xì)胞，為R1（A）；在R1細(xì)胞群中勾勒CD25、CD4雙陽性的細(xì)胞，為R2（B）；在R2細(xì)胞群中分析陽性表達(dá)FoxP3的細(xì)胞，即為Treg細(xì)胞（C）。Fig 1 Analysis Treg cells using FACS. According to the FSC and SSC, R1 (A) was gated； In R1 region, double staining (CD25 and CD4) cells weredefined as R2 (B)； In R2 region, Treg cells were defined as positive expression of FoxP3 (C).

圖 2 各組一例典型Treg細(xì)胞在小鼠肺部組織的表達(dá)。A：正常小鼠肺部的Treg細(xì)胞（15.56%）；B：生理鹽水治療的肺癌小鼠肺部的Treg細(xì)胞（21.48%）；C：紫杉醇治療的肺癌小鼠肺部Treg細(xì)胞（18.64%）。Fig 2 One typical case of Treg cells expression in each group. A: in lung tissue of normal mice (15.56%)； B: 3LL bearing mice pretreated with saline(21.48%)； C: 3LL bearing mice pretreated with paclitaxel (18.64%).

3 討論

TAP是參與腫瘤抗原遞呈的重要蛋白，TAP蛋白有兩個(gè)亞單位組成：TAP1，TAP2。它們負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)處理完成的抗原肽段轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。如果腫瘤細(xì)胞表面的TAP蛋白表達(dá)下降，將會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合物I類分子（major histocompatibility complex-I,MHC-I）的表達(dá)下降或缺如[4-6]，結(jié)果是腫瘤不呈現(xiàn)或僅呈現(xiàn)弱的抗原性，導(dǎo)致腫瘤抗原無法被遞呈給CD8+的T細(xì)胞，從而逃脫免疫監(jiān)管；這是腫瘤免疫逃逸的一個(gè)重要機(jī)制；而腫瘤免疫逃逸的另一個(gè)重要機(jī)制是指外周耐受，即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制作用；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）是一組具有免疫抑制功能的CD4+CD25+T細(xì)胞亞群，通過以下機(jī)制促進(jìn)腫瘤的免疫逃避：①通過細(xì)胞接觸依賴性機(jī)制或分泌IL-10、TGF-B的細(xì)胞因子抑制免疫細(xì)胞的功能；②通過與效應(yīng)細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-2抑制其增值；③誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞向免疫耐受方向發(fā)展[7]。

表 2 各組小鼠腫瘤局部的Treg細(xì)胞表達(dá)的比較Fig 2 The expression of Treg cells in each group

作為肺部腫瘤治療的重要組成部分——化學(xué)治療，在肺癌的免疫逃逸中發(fā)揮什么樣的作用成為近年來研究的熱點(diǎn)；紫杉醇是目前肺癌化療中的首選藥物；作為抗微管的化療藥物，干擾了微管系統(tǒng)中的動(dòng)態(tài)平衡，使細(xì)胞分裂停止在細(xì)胞周期的G2晚期和有絲分裂期，從而抑制肺癌細(xì)胞的復(fù)制。本研究試圖闡明紫杉醇對(duì)于逆轉(zhuǎn)肺癌逃脫免疫監(jiān)管的內(nèi)在機(jī)制；

我們的研究選擇體外5×10-8mol/L紫杉醇的濃度，因?yàn)?×10-8mol/L紫杉醇曾經(jīng)被證實(shí)能刺激體內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞發(fā)揮作用[3]，對(duì)應(yīng)于體外5×10-8mol/L的紫杉醇，小鼠腹腔內(nèi)的紫杉醇注射用量是0.012 5 mg/只[3]。

本研究指出，紫杉醇具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞表面降低表達(dá)TAP-1、TAP-2蛋白的作用；表現(xiàn)為紫杉醇上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面MHC-I類分子的表達(dá)。此外，本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了紫杉醇有利于消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用；Treg細(xì)胞的檢測(cè)在技術(shù)上一直是個(gè)難點(diǎn)，本研究采用流式三染的技術(shù)，將表達(dá)CD25、CD4 雙陽性的細(xì)胞再進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)叉頭蛋白（FoxP3）的染色。本研究指出，紫杉醇的化療消除了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤免疫中的抑制作用；本研究證明，化療并不是以往認(rèn)為的與機(jī)體的免疫是對(duì)抗或拮抗的；當(dāng)選擇適當(dāng)劑量的時(shí)候，化療藥物可通過促進(jìn)腫瘤抗原的暴露，消除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答的發(fā)生；從這點(diǎn)而言，化療藥物對(duì)于重建機(jī)體的免疫格局具有其獨(dú)特的貢獻(xiàn)。

進(jìn)一步地，本研究將繼續(xù)研究化療藥物對(duì)于免疫記憶細(xì)胞的影響；因?yàn)槔碚撋?，化療藥物成功殺傷腫瘤細(xì)胞，協(xié)同免疫系統(tǒng)清除腫瘤抗原，為記憶細(xì)胞的分化提供靜止期；另一方面，化療后機(jī)體經(jīng)歷淋巴細(xì)胞的自穩(wěn)性增生，使得腫瘤抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞的比例大大增加，使更多的細(xì)胞分化為相應(yīng)的記憶細(xì)胞[8,9]。

總之，依據(jù)化療后腫瘤細(xì)胞免疫原性的變化，設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療方案，將化療和免疫治療有機(jī)的結(jié)合，將最終提高抗腫瘤效應(yīng)，為臨床實(shí)踐帶來新思維。