中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700

苦寒類中藥是中藥的重要組成部分，常用于中醫(yī)臨床，中醫(yī)學(xué)認為“辛甘發(fā)散為陽，酸苦涌瀉為陰”。傳統(tǒng)的苦寒類中藥例如黃連、黃芩、黃柏、梔子、大黃等，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，其藥性寒涼傷陽，苦則化燥傷津，耗傷胃液[1]。有關(guān)“苦寒傷胃”之說一直被歷代中醫(yī)藥學(xué)家探討，有動物實驗表明長期大量使用苦寒中藥會造成小鼠脾胃功能受損，腸道菌群失調(diào)[2-3]。

黃連解毒湯是清熱解毒代表方劑，由黃連、黃芩、黃柏和梔子4味中藥按3:2:2:3的比例配伍而成，主治實熱火毒、三焦熱盛之證[4]。有研究顯示，長期高劑量應(yīng)用黃連解毒湯復(fù)方會導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)腸道益生菌（雙歧桿菌和乳酸桿菌）數(shù)量減少等情況，表現(xiàn)出類似濫用抗生素的破壞作用[5]；還有研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯低劑量使用或許有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用[5-6]。本實驗采用Illumina高通量測序技術(shù)檢測黃連解毒湯對健康大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為臨床合理使用清熱解毒方劑提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 GeneAmpR9700型PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品，Illumina MiSeq platform基因組分析平臺為美國Illumina公司產(chǎn)品，QuantiFluorTMST藍色熒光定量系統(tǒng)為美國Promega公司產(chǎn)品。AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AxyPrep DNA Gel Extration Kit）為美國 Axygen 公司產(chǎn)品（批號：19415KE1）；2%瓊脂糖凝膠與Tris-HCl均為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品(批號：16500500、15506017)；EZNA stool DNA kit為美國Omega Bio-tek公司產(chǎn)品 (批號：D4015-00)。

1.2 方法

1.2.1 黃連解毒湯提取物制備 黃連（Rhizoma Coptidis Franch.，產(chǎn)地為重慶石柱縣）、黃芩（Radix Scutellariae Georgi，產(chǎn)地為河北省承德圍場縣）、黃柏（Phellodendri Chinensis C.K.Schneid.，產(chǎn)地為重慶新都縣）、梔子（Gardeniae jasminoides J.Ellis，產(chǎn)地為江西省樟樹市），均購于北京仟草中藥飲片有限公司，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所何希榮教授鑒定可用于實驗研究。粉碎后，黃連、黃芩、黃柏、梔子按比例3:2:2:3混勻，依次用10倍量、8倍量水，分別提取兩次，每次1.5h，過濾，合并濾液，濃縮，80℃減壓干燥成粉。

1.2.2 標(biāo)本的采集與處理 雄性SPF級Wistar大鼠20 只，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011]，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2015-0041]。動物適應(yīng)期為7d。大鼠按體重分為兩組，空白對照組10只，分別以C1～C10表示；黃連解毒湯組10只，分別以H1～H10表示。

兩組大鼠第1次給藥前禁食12h，黃連解毒湯組按照700mg/kg的劑量給予黃連解毒湯提取物粉末溶液灌胃，使用劑量按臨床使用劑量進行折算，折合生藥劑量約為3.5g/kg；空白對照組給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。兩組均連續(xù)給藥7d，自由飲食。腹部擠壓法收集兩組大鼠第7天的糞便，糞便取出后裝入5mL離心管中，立即放入干冰轉(zhuǎn)移至-80℃保存。

1.2.3 腸道基因DNA的提取 采用試劑盒EZNA stool DNA kit提取細菌總DNA。具體操作按照試劑盒說明書進行，DNA提取完成后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA完整性和DNA總量。

1.2.4 PCR擴增16S rRNA基因V3-V4區(qū) 16S rRNA基因V3-V4區(qū)PCR擴增所用引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’），806R （5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。反應(yīng)體系為：5×Fast Pfu Buffer 4μL，2.5mmol·L-1dNTPs 2μL，5μmol·L-1上游引 物 0.6μL，5μmol·L-1下 游 引 物 0.6μL，F(xiàn)ast Pfu Polymerase 0.4μL，Template DNA 10ng。反應(yīng)條件：95℃ 2min，95℃ 0.5min，27個循環(huán)。55℃ 0.5min，72℃0.75min，72℃ 10min，10℃結(jié)束。每個樣本重復(fù)3次，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 熒光定量 PCR產(chǎn)物采用QuantiFluorTMST藍色熒光定量系統(tǒng)進行定量檢測，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應(yīng)比例混合。

1.2.6 Miseq文庫構(gòu)建 連接“Y”字形接頭；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR擴增進行文庫模板的富集；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

1.2.7 Miseq上機測序 DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；另一端隨機與附近的另外一個引物互補，固定形成“橋 (bridge)”；PCR擴增，產(chǎn)生DNA簇；DNA擴增子線性化成為單鏈；加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團”和“終止基團”化學(xué)切割，恢復(fù)3'末端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸；統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，對屬于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料進行對數(shù)處理后（log copies/g）以±s表示，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腸道細菌總DNA完整性、純度測定 采用NanoDrop超微量分光光度法測定總DNA的OD260/OD280的比值均在1.6～1.9，說明提取的DNA純度較高，無蛋白質(zhì)及RNA污染。所提取的DNA樣品取2μL進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳可見清晰條帶，提示DNA樣品完整性良好。見圖1。

2.2 PCR擴增結(jié)果 PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適，可進行后續(xù)實驗。見圖2。

圖1 大鼠腸道細菌總DNA瓊脂糖電泳圖Fig.1 DNA glue diagram of intestinal flora in rats

2.3 兩組大鼠腸道菌群門和屬水平上的結(jié)構(gòu)差異采用兩獨立樣本t檢驗對兩組大鼠腸道菌群門、屬水平進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組樣本中以厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）豐度較高。經(jīng)t檢驗和FDR校正提示，服用黃連解毒湯臨床劑量7d后可以顯著降低正常大鼠腸道中放線菌門和厚壁菌門細菌占總菌的比例，兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、表1。

圖2 16S rRNA基因V3-V4區(qū)PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of V3-V4 area of 16S rRNA

圖3 兩組大鼠腸道菌群門水平比較Fig.3 Comparison of intestinal flora between two groups on the levels of phylum

屬水平分析結(jié)果提示，黃連解毒湯組大鼠腸道中Adlercreutzia菌屬、克里斯滕森菌屬（Christensenellaceae）、消化鏈球菌屬（Peptococcaceae）比例低于空白對照組，而嗜膽菌屬（Bilophila）比例則高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖 4、表2。

表1 兩組大鼠腸道菌群門水平比較（±s,%）Tab.1 Comparison of intestinal flora between two groups on the levels of phylum（±s,%）

表1 兩組大鼠腸道菌群門水平比較（±s,%）Tab.1 Comparison of intestinal flora between two groups on the levels of phylum（±s,%）

名稱 n 黃連解毒湯組放線菌門（Actinobacteria）厚壁菌門（Firmicutes）10 10 0.027±0.025 29.783±16.041空白對照組 P值0.070±0.043 43.772±6.630 0.013 0.020

圖4 兩組大鼠腸道菌群屬水平比較Fig.4 Comparison of intestinal flora between two groups on the level of genus

表2 兩組大鼠腸道細菌屬水平菌群比較（±s,%）Tab.2 Comparison of intestinal flora between two groups on the level of genus（±s,%）

表2 兩組大鼠腸道細菌屬水平菌群比較（±s,%）Tab.2 Comparison of intestinal flora between two groups on the level of genus（±s,%）

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3 討論

腸道菌群被視為人體的一個重要“器官”[7]，能夠調(diào)節(jié)宿主的三大物質(zhì)代謝。健康大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)受到宿主遺傳表型、飲食、性別等因素的影響。當(dāng)宿主各方面相對穩(wěn)定的情況下，宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化很大程度上與機體的生理及病理狀態(tài)有關(guān)。本實驗通過單變量分析，采用Illumina高通量測序方法對黃連解毒湯組和空白對照組大鼠腸道的菌群進行定量檢測，結(jié)果顯示在臨床劑量下，連續(xù)服用黃連解毒湯7d能夠引起健康大鼠部分腸道菌群比例的明顯變化。

在門水平菌群變化中，與空白對照組比較，服用黃連解毒湯臨床劑量7d后可以顯著降低健康大鼠腸道中放線菌門和厚壁菌門細菌所占的比例，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。其中，放線菌能產(chǎn)生豐富的生物活性物質(zhì)，是天然藥物的重要來源，其代謝活性物質(zhì)具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒等活性，至今發(fā)現(xiàn)的天然抗生素中有三分之二是由放線菌產(chǎn)生，放線菌已被認為是新抗生素產(chǎn)生的主要來源[8-9]。服用黃連解毒湯臨床劑量7d后，放線菌門比例顯著下降，說明一定劑量的黃連解毒湯可能能夠調(diào)節(jié)菌群比例，這與文獻報道低劑量黃連解毒湯或許有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用相符合[5-6]。

厚壁菌門是人體及高等哺乳動物腸道內(nèi)最有優(yōu)勢的一大類細菌，比例約占總菌群的50%～60%，厚壁菌門是一類與肥胖有關(guān)的腸道菌，能夠降解不溶性纖維。研究證實，腸道正常菌群可能參與飲食引起的肥胖，當(dāng)腸道內(nèi)厚壁菌門的含量超過擬桿菌門，對食物中熱量的吸收會更有效，從而導(dǎo)致機體肥胖[10]。文獻報道，“中滿內(nèi)熱”是肥胖2型糖尿病的核心病機，以苦寒類中藥治療，清熱燥濕、瀉火解毒能夠重折其熱、護衛(wèi)陰液[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯除了解熱、抗菌、抗炎外，還具有抗氧化、改善腦缺血、降血糖、降血脂、抗腫瘤等作用[4,12]。研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的黃連解毒湯持續(xù)給藥能有效調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂代謝和炎癥因子；可對抗高脂所致的大鼠血糖升高，降低大鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C） 水 平 及 脂 肪 組 織CCAAT增強子結(jié)合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein α，CEBPα）水平，升高血清高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平，使得大鼠體重減輕[13-15]。本研究提示，黃連解毒湯可顯著降低大鼠腸道厚壁菌門細菌的比例，提示黃連解毒湯對體重可能會有一定的改善作用，與文獻報道結(jié)果相符。

在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯能夠引起大鼠腸道4個關(guān)鍵菌屬發(fā)生變化，其中Adlercreutzia菌、消化鏈球菌和克里斯滕森菌所占總菌的比例顯著降低，而嗜膽菌所占比例增加。Adlercreutzia菌具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用；克里斯滕森菌與肥胖指數(shù)有關(guān)[16]；消化鏈球菌是革蘭陽性厭氧球菌中最常見的菌種，易變?yōu)楦锾m陰性菌，是人體口腔、上呼吸道、腸道和女性生殖道的正常菌群[17]，常和其他菌混合感染，也可單獨感染；嗜膽菌會引發(fā)小鼠結(jié)腸炎，以動物制品為主要食物的動物腸道中豐度會顯著增加[18]。消化鏈球菌等致病菌的豐度顯著性下降，說明黃連解毒湯在抗菌及抗炎方面存在一定療效，而對Adlercreutzia菌、嗜膽菌、克里斯滕森菌等菌屬的具體作用機制仍待進一步研究。一定劑量的黃連解毒湯給藥后通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵菌屬的豐度比例，從而調(diào)整腸道微生物穩(wěn)態(tài)，由此可能進一步影響到大鼠的正常生長，這可能與菌屬本身具有免疫調(diào)節(jié)作用，易致炎癥產(chǎn)生等特點有關(guān)，同時也取決于大鼠本身的生理狀態(tài)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的黃連解毒湯可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群的種類、數(shù)量、比例等，影響腸道微生物穩(wěn)態(tài)。本研究為黃連解毒湯的臨床應(yīng)用提供了參考，而黃連解毒湯影響腸道菌群的具體機制有待于進一步研究。