浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所 杭州 310053

“上火”是中醫(yī)學(xué)上特有的病名，屬于“火熱證”范疇。調(diào)查顯示在中國(guó)91%的成年人有過(guò)“上火”經(jīng)歷[1]?！吧匣稹卑Y狀表現(xiàn)形式多樣，包括口腔潰瘍、牙齦紅腫、唇周面部皰疹、雙目紅赤、口干眼干、尿赤、便秘等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)把“上火”視為“亞健康”狀態(tài)和代償范圍內(nèi)的急性應(yīng)激反應(yīng)，是免疫功能下降時(shí)出現(xiàn)的炎癥和局部感染[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)“上火”相關(guān)病證的研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病多與環(huán)境、飲食、情志、遺傳、免疫、微生物等因素相關(guān)[3]。

情志刺激、過(guò)食辛辣燥熱、勞累過(guò)度和微生物感染等因素可引起體內(nèi)微環(huán)境變化，導(dǎo)致黏膜上皮組織的糖酵解功能活躍，從而導(dǎo)致能量代謝紊亂，進(jìn)一步引起黏膜損傷，使黏膜免疫系統(tǒng)中Th17/Treg細(xì)胞比例上調(diào)，分泌型免疫球蛋白A（immunoglobulin A,I－gA）分泌減少，局部黏膜免疫力下降，易繼發(fā)感染，進(jìn)而加重黏膜損傷[4]。因此，“上火”人群中普遍存在著體內(nèi)能量代謝的紊亂及黏膜免疫的異常。

近年來(lái)，研究證實(shí)腸道微生物在機(jī)體能量代謝和黏膜免疫方面發(fā)揮重要作用[5-6]。腸道微生物通過(guò)多條途徑參與機(jī)體的能量代謝，包括對(duì)不能被人體細(xì)胞消化的膳食纖維進(jìn)行酵解、對(duì)肽類或蛋白質(zhì)進(jìn)行無(wú)氧酵解、膽汁酸的生物轉(zhuǎn)化和草酸鹽復(fù)合物的降解等[7]。另外，腸道菌群可通過(guò)在腸道中定植，構(gòu)建腸道免疫屏障；腸道細(xì)菌在死亡或增殖時(shí)，不斷向外界釋放脂多糖、肽聚糖或磷脂壁酸等刺激物，這些物質(zhì)進(jìn)入血液，從而引起全身黏膜免疫反應(yīng)[6]。綜上所述，腸道菌群可通過(guò)影響能量代謝和黏膜免疫，參與“上火”的發(fā)生。

為明確“上火”人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征，本研究采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)檢測(cè)“上火”人群和健康人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步了解“上火”相關(guān)的腸道菌群種類的變化。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源 樣本采集時(shí)間為2016年8月至2017年5月,采集對(duì)象為浙江中醫(yī)藥大學(xué)全日制各專業(yè)在讀本科生。所有研究對(duì)象均自愿加入“上火”項(xiàng)目研究，均符合相應(yīng)的中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)、“上火”人群和健康人群的納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)、納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1“上火”人群診斷標(biāo)準(zhǔn) 采用專家咨詢法，確定“上火”的診斷標(biāo)準(zhǔn)：1個(gè)主癥（頭面部癥狀）或2個(gè)次癥（至少1個(gè)為頭面部癥狀）。主癥：牙齦腫痛、咽喉腫痛、口臭、口腔潰瘍、鼻瘡癤、熱瘡（顏面部皰疹）、口苦和目赤干澀。次癥：口角糜爛、目眵增多、口渴、舌痛、痤瘡、鼻腔干燥、齒衄、鼻衄、聲音嘶啞、頭痛、大便干結(jié)、小便黃、心煩、五心煩熱、多食易饑、痔瘡發(fā)作、潮熱和失眠。

1.2.2 健康人群入選標(biāo)準(zhǔn) 正常對(duì)照組為健康的大學(xué)生，近半年內(nèi)無(wú)“上火”病史（根據(jù)前文提到的“上火”診斷標(biāo)準(zhǔn)），無(wú)心腦血管病史及其他重大內(nèi)科疾病史，無(wú)結(jié)核、傷寒或肝炎等傳染病史；三大常規(guī)、肝腎功能、胸片、B超、心電圖等指標(biāo)無(wú)明顯異常；體格檢查無(wú)明顯異常；近1個(gè)月內(nèi)無(wú)腹瀉或胃腸病史，無(wú)用藥及服用微生態(tài)制劑史；無(wú)吸煙、飲酒等不良嗜好；舌質(zhì)淡紅，苔薄白，脈象正常。

1.2.3 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合“上火”的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）符合上述標(biāo)準(zhǔn)的健康體檢者；（3）年齡18～35歲；（4）自愿參加本實(shí)驗(yàn)并簽署臨床研究知情同意書。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）由于抗生素、激素等藥物的使用引起“上火”表現(xiàn)者；（2）有重大內(nèi)科疾病、消化道疾病者或精神疾病不能配合者；（3）妊娠或哺乳期婦女；（4）存在研究者認(rèn)為不適合納入的其他情況。

1.3 樣本采集 樣本采集前，采用調(diào)查問(wèn)卷形式詳細(xì)記錄受試者的年齡、性別、身高、體質(zhì)量、飲食習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)等特征，記錄中醫(yī)證候。糞便樣本采集前，先排凈小便，防止尿液污染糞便。用無(wú)菌一次性采樣杯采集新鮮糞便樣本后置于冰盒內(nèi)，迅速將糞便運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行按20mg/管分裝，隨即置于-80℃冰箱中保存。

1.4 標(biāo)本收集及檢測(cè)

1.4.1 糞便DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序 采用糞便DNA提取試劑盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品，批號(hào)：51304）抽提糞便DNA。檢查DNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。合格后，采用16S rRNA基因的V3-V4區(qū)引物對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增引物上下游分別是上游5’-X-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’ 和 下 游 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，引物由Invitrogen公司合成，“X”為區(qū)別不同樣本的8個(gè)隨機(jī)組合的核苷酸堿基片段（barcode）。PCR擴(kuò)增前，模板濃度統(tǒng)一稀釋到 20ng·μL-1。擴(kuò)增體系如下：5×反應(yīng)緩沖液 5μL、5×GC 緩沖液 5μL、100mmol·L-1dNTP 5μL、10μmol·L-1上游引物 1μL、10μmol·L-1下游引物 1μL、DNA 模板2μL、ddH2O 6μL。反應(yīng)總體系共 25μL。反應(yīng)條件：初始變性 98℃ 2min，變性 98℃ 15s，退火 55℃ 30s，延伸72℃ 30s，共25個(gè)循環(huán)。72℃延伸5min，10℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)檢合格后，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行250bp×2雙末端測(cè)序；下機(jī)進(jìn)行測(cè)序原始數(shù)據(jù)整理、過(guò)濾及質(zhì)量評(píng)估；序列進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾后，接下來(lái)進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units,OTUs）列表生成及注釋。

1.4.2 數(shù)據(jù)整理、過(guò)濾及質(zhì)量評(píng)估 測(cè)序完成后，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，步驟如下：（1）采用滑動(dòng)窗口法對(duì)雙端的FASTQ序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù)；（2）利用FLASH軟件（v1.2.7）對(duì)通過(guò)質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進(jìn)行配對(duì)連接，并根據(jù)barcode序列將序列拆分，各自回歸到對(duì)應(yīng)樣品；（3）運(yùn)用QIIME軟件（v1.8.0）識(shí)別疑問(wèn)序列，保留長(zhǎng)度＞150bp和不存在模糊堿基N的序列，并調(diào)用USEARCH（v5.2.236）檢查并剔除嵌合體序列，從而獲得最后用于分析的序列。

1.4.3 多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析 調(diào)用QIIME軟件中的UCLUST程序，對(duì)獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，根據(jù)OTU在每個(gè)樣本中所包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件。采用QIIME軟件對(duì)樣品序列進(jìn)行Alpha多樣性分析，包括ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)，并采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩類人群間單因素方差分析。選擇OTUs中的一條代表序列（默認(rèn)豐度最高），采用Ribosomal數(shù) 據(jù) 庫(kù) （Ribosomaldatabase project，RDP）進(jìn)行OTU分類地位鑒定。使用R軟件，根據(jù)OTU豐度矩陣和樣本分組數(shù)據(jù)構(gòu)建PCoA分析，評(píng)估微生物群落的整體差異；根據(jù)OTU豐度矩陣表，使用在線分析軟件LEfSe（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）分析健康人群與“上火”人群間差異的腸道菌群種類，線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）得分大于 2，且 Kruskall-Wallis檢驗(yàn)值小于0.05即為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 受試者臨床樣本信息統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)上述診斷、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入35例“上火”人群，男女比例為0.84:1，平均年齡為24.4歲，平均體重指數(shù)（body mass index，BMI）為 23.2kg/m2。為匹配“上火”人群的樣本信息，同時(shí)收集了健康人群35例，男女比例為0.67:1，平均年齡為23.7歲，平均BMI為22.3kg/m2。見(jiàn)表1。兩組基本信息采用方差分析比較，結(jié)果顯示組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 臨床研究人群基本信息Tab.1 Basic information of clinical study population

2.2 兩組受試者Alpha多樣性指數(shù)比較分析 本研究采用Chao1和ACE兩種Alpha多樣性指數(shù)反映健康人群和“上火”人群的腸道菌群多樣性?！吧匣稹比巳旱哪c道微生物多樣性平均指數(shù)均低于健康人群，但兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。一般來(lái)說(shuō)，Alpha多樣性指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。因此，“上火”可能會(huì)導(dǎo)致腸道菌群多樣性略微降低。見(jiàn)圖1。

圖1 健康人群與“上火”人群的Alpha多樣性指數(shù)比較Fig.1 Comparison of Alpha indices between healthy and“Shanghuo”individuals

2.3 兩組受試者Beta多樣性比較分析 健康人群和“上火”人群的腸道菌群差異可以通過(guò)PCoA分析進(jìn)行歸類，PC1和PC2分別為12.94%和6.26%。兩種人群在PCoA圖上均能各自聚類，但有部分重疊，說(shuō)明兩類人群的腸道菌群Beta多樣性具有差異。見(jiàn)圖2。

2.4 健康人群與“上火”人群的差異腸道菌群分析圖3展示了健康人群和“上火”人群之間的差異腸道菌群發(fā)育樹圖，由LEfSe在線分析程序獲得，其中顯著差異的logarithmic LDA score設(shè)為3。綠色節(jié)點(diǎn)代表健康人群高于“上火”人群的腸道菌群種類，紅色節(jié)點(diǎn)代表“上火”人群顯著高于健康人群的腸道菌群種類。

圖2 基于OTU豐度矩陣表的PCoA判別分析Fig.2 PCoA analysis based on OTU abundance of gut microbiome individuals.

圖3 健康人群與“上火”人群間差異腸道菌群的LEfSe分析Fig.3 LEfSe analysis reveals the significantly different gut microbiota between healthy and“Shanghuo”individuals

在微生物門水平上，健康人群與“上火”人群間顯著差異的種類包括6個(gè)，分別是放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和迷蹤菌門（Elusimicrobia），前三個(gè)門在“上火”人群腸道內(nèi)含量顯著上調(diào)，后三個(gè)門在“上火”人群腸道內(nèi)含量顯著下調(diào)。

在微生物屬水平上，LEfSe共鑒定出13個(gè)屬在兩種人群中存在顯著差異。在放線菌門（Firmicutes）中，包括8個(gè)顯著差異屬，分別是厭氧管狀菌屬A（Naerofustis）、布勞特菌屬（Blautia）、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、顫螺菌屬（Oscillospira）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、厭氧弧菌屬（Anaerovibrio）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium） 和糞芽孢菌屬（Coprobacillus），它們均在“上火”人群中顯著上調(diào)。變形菌門（Proteobacteria）包括2個(gè)在“上火”人群腸道內(nèi)顯著上調(diào)的屬，分別是固氮螺菌屬（Azospirillum）和叢毛單胞菌屬（Comamonas）。除了在“上火”人群中上調(diào)的微生物屬，還包括“上火”人群中下調(diào)的微生物屬，分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）中的B擬桿菌屬（Acteroides）和普氏菌屬（Prevotella），及螺旋體門（Spirochaetes）中的密螺旋體屬（Treponema）。在放線菌門（Actinobacteria）和迷蹤菌門（Elusimicrobia）中未發(fā)現(xiàn)顯著差異的屬。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為“上火”者體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)陰陽(yáng)失衡、火熱旺盛，導(dǎo)致能量代謝紊亂及黏膜免疫失調(diào)。腸道微生物可參與機(jī)體能量的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化、儲(chǔ)存和利用，并通過(guò)改變組織對(duì)能量的利用方式和AMP依賴的蛋白激酶（adenosine 5’monophosphate activated protein kinase，AMPK）磷酸化等途徑來(lái)影響機(jī)體的能量代謝[8]；同時(shí)，腸道菌群可調(diào)控免疫效應(yīng)因子，如sIgA的產(chǎn)生，以及模式識(shí)別受體如Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）等的活化，從而影響機(jī)體的腸道黏膜免疫[9]。因此，本研究結(jié)果揭示的“上火”人群腸道微生物的變化，有助于解析“上火”能量代謝物紊亂和黏膜免疫失調(diào)的現(xiàn)象。

在腸道微生物中，厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）是兩個(gè)占主要地位的門，兩者比例在90%以上[6]。厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）比例的上調(diào)指示了肥胖患者腸道內(nèi)的慢性炎癥發(fā)生[10]。在“上火”人群腸道內(nèi)，厚壁菌門/擬桿菌門的比例也出現(xiàn)明顯上調(diào)，這說(shuō)明“上火”人群的腸道內(nèi)可能存在炎癥。除此之外，食用肉類增加或食用纖維素下降可上調(diào)厚壁菌門/擬桿菌門的比例[11]，上述飲食習(xí)慣也是“上火”的主要誘因。

在微生物屬水平上，某些變化的腸道微生物屬與“上火”相關(guān)的能量代謝紊亂相關(guān)。顫螺菌屬（Oscillospira）能幫助宿主細(xì)胞降解糖類物質(zhì)，從而提供能量[12]；瘤胃球菌屬（Ruminococcus）通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸類物質(zhì)為宿主細(xì)胞提供能量[13]；考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）在腸道內(nèi)可通過(guò)降解琥珀酸鹽為宿主提供能量[14]。因此，這些與宿主能量代謝相關(guān)的菌屬在“上火”人群中上調(diào)，可能是引起能量代謝紊亂的因素之一。另外，某些變化的腸道微生物屬也與“上火”相關(guān)的免疫失調(diào)相關(guān)：瘤胃球菌屬（Ruminococcus）豐度上調(diào)，可導(dǎo)致腸道黏膜層降解，腸道屏障不穩(wěn)定和輕度黏膜免疫失調(diào)[15]；普氏菌屬（Prevotella）通過(guò)活化TLR2，調(diào)控Th17細(xì)胞相關(guān)的免疫因子，從而引起黏膜免疫失調(diào)[16]；棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）可通過(guò)調(diào)控核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）途徑，抑制炎癥反應(yīng),幫助宿主機(jī)體抵抗炎癥[17]。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)“上火”發(fā)生與腸道菌群改變相關(guān)，變化的腸道菌群在一定程度上能反映“上火”導(dǎo)致的能量代謝紊亂和黏膜免疫失衡。