陳仙英徐莉李思敏汪琴靜包潔季巾君謝冠群范永升

1.浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院 3.浙江中醫(yī)藥大學附屬江南醫(yī)院

實熱證為體內陽熱之氣過盛、邪熱亢盛，多為內外俱實的病證，病勢急驟，常見于形體壯實者[1]?！兜は姆ā吩唬骸皻庥杏啾闶腔穑蛔阏邽闅馓?。”[2]說明補氣太過，氣化過盛也會導致火熱之證，產生傷津耗液的病理損害，可表現(xiàn)為實火或實熱證[3]。文獻報道，熱證患者臨床上多表現(xiàn)為代謝機能旺盛，神經、內分泌、代謝等方面呈病理性機能亢奮狀態(tài)[4-5]。動物研究發(fā)現(xiàn)，熱證模型大鼠具有腎上腺素水平升高，紅細胞膜鈉泵活性升高，肝細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活力升高等特點[6]。

利用實驗動物研究實熱證機制主要有中醫(yī)傳統(tǒng)誘因模擬和西醫(yī)病理復制兩種造模方式[7]。中醫(yī)傳統(tǒng)誘因模擬多采用熱性藥干姜、附子、肉桂或者補氣藥黨參、黃芪等造模[8-9]，西醫(yī)病理復制模型多采用化學試劑如2，4-二硝基苯酚、干酵母、內毒素、二甲苯等造模[10]。雖然目前利用化學、生物等方法造成實熱證模型居多，但均為單純使用化學試劑造成的模型，與中醫(yī)病證形成的病因無關，不符合中醫(yī)臨床實熱證的特色。黃芪性甘，微溫，具有補氣健脾、升陽舉陷、益衛(wèi)固表等功效；而紅參是人參的熟制品，其藥性更溫，具有火大、勁足、功效強的特點，兩者都是補氣要藥，可提高內分泌和交感神經的機能活動[11]，大劑量服用易產生實熱證的表型。所以本次研究主要采用了紅參、黃芪模擬中醫(yī)誘因聯(lián)合西醫(yī)病理復制的方法制備實熱證大鼠模型，通過研究實熱證大鼠血液內環(huán)境氧化應激狀態(tài)的變化及其血液內小分子代謝物的改變，探討實熱證的病理生理機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠，體質量（160±20）g，共40只，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號 [SYXK（浙）2018-0012]。

1.2 主要試劑和藥品 紅參、黃芪干燥藥材均購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠；松節(jié)油購于湖南爾康制藥股份有限公司（批號：Z43020065）；色譜級甲醇、色譜級乙腈購于美國Tedia公司（批號：MS1992-801、AS1122-801）；色譜級甲酸購于阿拉丁公司（批號：F112034）。丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒和谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒購于南京建成生物工程公司（批號：20140117、20140115、20140116）；17-羥皮質類固醇（17-hydroxycorticosteroid，17-OHCS）ELISA 檢測試劑盒和促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）ELISA檢測試劑盒均購自上海晶抗生物工程有限公司 [批號：JK（a）-1576、JK（a）-1552]。

1.3 主要儀器及軟件 1260 HPLC-6520 Q-TOF/MS儀及配件包括G133柱溫箱、G1367可溫控自動進樣器、G1322A在線脫氣機、G1312二元高壓泵、E－clipse Plus C18色譜柱均購自美國安捷倫科技有限公司；R202型旋轉蒸發(fā)器購于上海申勝生物技術有限公司；Centrifuge 5417R高速冷凍離心機購于德國Eppendorf公司；多功能酶標儀為美國Thermo Scientific公司產品；超低溫冰箱為日本Sanyo公司產品。SIMCA-P軟件購于瑞士 Umetrics AB公司；Mass Hunter軟件和Mass Profiler Professional軟件均購自美國安捷倫科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 清潔級雄性Wistar大鼠40只，適應性喂養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分為兩組，即實熱組和正常對照組，每組各20只。

1.4.2 中藥水煎劑及大鼠模型制備 中藥材紅參500g、黃芪500g，以單蒸水1 000mL煎煮1h，常規(guī)煎兩次，將兩次水煎劑混合后，再用R202型旋轉蒸發(fā)器將水煎劑濃縮至1g·mL-1。中藥水煎劑大鼠灌胃量計算如下，首先以60kg體質量的成人藥物使用量代入公式，然后結合大鼠的體質量用下述公式換算出大鼠每日最大中藥水煎劑的灌胃量，計算公式如下，K鼠/K人為人和大鼠間按體表面積換算的等效劑量比值。

實熱組次日起用中藥水煎劑，4mL/d，分兩次灌胃，共1周，背部皮下注射松節(jié)油（致熱物）2mL使其發(fā)熱；正常對照組則每只予等量的0.9%氯化鈉溶液，分兩次灌胃，共1周。

1.4.3 檢測指標及方法

1.4.3.1 大鼠基礎代謝數(shù)據(jù)的測定 各組大鼠隨機選取10只進行數(shù)據(jù)測定。從實驗開始起至灌胃結束（為期7d），每日灌胃前測量，并記錄兩組大鼠飲水瓶重量，計算各組大鼠日均飲水量。計算公式如下：

皮下注射松節(jié)油之后2d，每日上午8點采用溫度計插入肛門內測量安靜狀態(tài)下的大鼠肛溫。建模成功標準為飲水量增多，肛溫達39℃以上并持續(xù)2d；血清內TSH及17-OHCS含量均升高。建模過程中無動物損耗。

1.4.3.2 血清中TSH及17-OHCS含量的測定 造模結束后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經腹主動脈取血5～10mL，平均分裝于EDTA抗凝試管和促凝管，EDTA抗凝試管于2 000r/min，離心15min，分離血漿；促凝管靜置約1h后，于3 000r/min，離心10min，分離血清。血漿及血清樣本分別分裝于1.5mL的EP管內，標記后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA檢測血清中TSH及17-OHCS含量，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.4.3.3 血漿中MDA、GSH、T-AOC的水平測定 各組大鼠隨機選取10只進行數(shù)據(jù)測定。采用硫代巴比妥法檢測血漿中MDA的水平，分光光度計法檢測血漿中GSH的水平，化學比色法檢測血漿中T-AOC的水平，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.4.3.4 液相色譜-質譜聯(lián)用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）鑒定血清中的小分子代謝物 室溫下解凍所采集血清樣品，取150μL置于離心管中，加入450μL乙腈沉淀蛋白，渦旋30s，靜置10min后，4℃下 12 000r/min離心 10min，取 300μL上清液以去離子水1:1稀釋，稀釋后的600μL血清樣品用0.22μm尼龍膜過濾，棄去初始濾液，用于LCMS分析。色譜條件：流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脫，起始梯度為20%B并維持2min，在10min內增至65%B，12min內增至85%B，然后在2min內升至98%B并維持2min，后運行時間為5min，流速為0.2mL/min。設置柱溫箱溫度為35℃，自動進樣器溫度為5℃，進樣量為5μL。質譜條件：分別使用ESI正、負離子模式采集數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采集質荷比范圍為：50～1 000m/z，干燥氣為 N2，干燥氣溫度為350℃，正、負離子模式毛細管電壓分別為4 000V、3 500V，碎裂電壓為180V，錐孔電壓分別為60V，霧化器壓力為275.8kPa。使用Centroid模式保存質譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集速率為2spectrum/s。數(shù)據(jù)采集過程中參比液實時監(jiān)測校準質譜系統(tǒng)。二級質譜數(shù)據(jù)采集時，碰撞能設置為20eV，二級質譜采集速率為2spectrum/s。

使用Mass Profiler軟件，對實熱組和正常對照組原始數(shù)據(jù)進行預處理，并在Excel 2010軟件中進行歸一化及后期編輯，將最終結果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量保留時間-質荷比（mass-to-charge ratio，rt-m/z）、分子質量、觀察量（樣本）和峰強。本項目樣本在該模式下共得到1 069個features。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導入SIMCA-P軟件（v 13.0）進行無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）對數(shù)據(jù)進行模式識別。并進一步采用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）進行建模分析。采用OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值，并結合t檢驗的P值來尋找差異性表達代謝物，要求VIP值＞1，P＜0.05。差異性代謝物的定性方法為：搜索Metlin在線數(shù)據(jù)庫，比較質譜的質荷比m/z或者精確分子質量（mass）。將得到的總差異物質輸入到Metabo Analyst 3.0中，獲得這些差異物質所在的代謝通路。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用±s表示，均值間差異比較用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的飲水量、肛溫水平及血清內TSH及17-OHCS含量比較 結果顯示，實熱組大鼠在灌胃期間飲水量增多，每日飲水量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。皮下注射松節(jié)油之后，實熱組大鼠肛溫達39℃以上并持續(xù)2d，均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。實熱組大鼠血清內TSH及17-OHCS含量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3。以上指標均符合實熱證動物模型的判定標準，表明該模型建立成功。

表1 兩組大鼠日均飲水量比較（±s，g）Tab.1 Comparison of daily drinking water in two groups(±s,g)

表1 兩組大鼠日均飲水量比較（±s，g）Tab.1 Comparison of daily drinking water in two groups(±s,g)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05.

組別n 日均飲水量實熱組正常對照組10 10 18.64±3.61*14.48±3.18

表2 兩組大鼠前兩天日均肛溫比較（±s，℃）Tab.2 Comparison of daily average anus temperature in two groups(±s,℃)

表2 兩組大鼠前兩天日均肛溫比較（±s，℃）Tab.2 Comparison of daily average anus temperature in two groups(±s,℃)

注：與正常對照組同時點比較，**P＜0.01。Note:Compared with control group at the same time,**P＜0.01.

組別 n 第1天日均肛溫 第2天日均肛溫實熱組正常對照組10 10 39.65±0.59**39.00±0.20 39.67±0.59**39.01±0.20

表 3 兩組大鼠血清 TSH、17-OHCS 含量比較（±s，mU·L-1）Tab.3 Comparison of serum levels of TSH,17-OHCS in two groups(±s,mU·L-1)

表 3 兩組大鼠血清 TSH、17-OHCS 含量比較（±s，mU·L-1）Tab.3 Comparison of serum levels of TSH,17-OHCS in two groups(±s,mU·L-1)

注：與正常對照組比較，**P＜0.01。Note:Compared with control group,**P＜0.01.

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2.2 兩組大鼠的血漿中MDA、GSH、T-AOC的水平比較 與正常對照組比較，實熱組大鼠血漿中MDA、GSH、T-AOC 水平明顯升高（P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。見表4。

表4 兩組大鼠血漿中MDA、GSH、T-AOC水平比較（±s）Tab.4 Comparison of concentration level of MDA,GSH and T-AOC in two groups(±s)

表4 兩組大鼠血漿中MDA、GSH、T-AOC水平比較（±s）Tab.4 Comparison of concentration level of MDA,GSH and T-AOC in two groups(±s)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05.

組別 n T-AOC（U·mL-1）實熱組正常對照組10 10 3.89±2.44*1.57±1.50 MDA（nmol·L-1） GSH（μmol·L-1）3.03±0.87*1.48±0.33 21.82±2.72*4.75±1.50

2.3 兩組大鼠血清代謝物典型LC-MS總離子流色譜圖 圖1為質控品多次重復進樣所得總離子流（total ion current，TIC）重疊圖。初步觀察發(fā)現(xiàn)儀器的保留時間重現(xiàn)性非常好，儀器穩(wěn)定，這些結果表明質譜系統(tǒng)有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.4 血清樣品的LC-MS分析及差異代謝物的挖掘鑒定 正常對照組選取16只，實熱組選取6只進行測定。為了判別兩組之間是否具有差異，本研究采用PCA建模方法對樣本進行分析。對實熱組和正常對照組進行PCA獲得PCA得分圖，該模式下共獲得3個主成分，累積R2X=0.357，Q2=0.064。見圖2。采用監(jiān)督性的多維統(tǒng)計方法即PLS-DA對兩組樣本進行分析。其模型質量參數(shù)為，R2X=0.327，R2Y=0.998，Q2=0.945。從模型的參數(shù)來看，尋找差異物質是可靠的，不存在“過擬合”現(xiàn)象。見圖3。進一步采用OPLS-DA進行建模分析，結果該模式下得到2個主成分和1個正交成分，R2X=0.327，R2Y=0.998，Q2=0.8。見圖 4。結果顯示，與正常對照組大鼠比較，實熱組大鼠血清中溶血卵磷脂、二十碳五烯酸、皮甾酮等物質含量降低（P＜0.01），棕櫚酸、鞘氨醇含量升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表5。

圖1 兩組大鼠樣本總離子流重疊圖Fig.1 Total ions chromatogram of sample of two groups

圖2 兩組大鼠PCA得分Fig.2 PCA scores of two groups

圖3 兩組大鼠PLS-DA得分Fig.3 PLS-DA scores of two groups

圖4 兩組大鼠OPLS-DA得分Fig.4 OPLS-DA scores of two groups

表5 差異代謝物鑒別結果Tab.5 Differential metabolite identification results

3 討論

實熱證是臨床上常見的證型。我國最早關于熱證的描述記載于《黃帝內經》中：“人之傷于寒也，則為病熱。”《千金方》《景岳全書》《醫(yī)宗金鑒》等著作中也記載著關于臟腑的熱證，如肺實熱、胃實熱、腸道濕熱證等。近年來，人們已經開始運用現(xiàn)代科學方法來研究實熱證，對實熱證有了新的認識[12]。

傳統(tǒng)醫(yī)學認為人體內外都是以陰陽平衡的形式存在，美國Brunswick研究中心在比較東西方文化中提出的陰陽學說與抗氧化的關系時，認為過氧化及抗氧化平衡狀態(tài)與體內的陰陽制約過程相關[13]。而熱證則是由于各種原因使人體內的陰陽平衡遭到破壞而出現(xiàn)的一些癥狀。因此，機體所表現(xiàn)的“火熱”的生理反應可能對應機體內的氧化應激過程[14]。MDA是自由基作用于脂質發(fā)生的過氧化反應產物[15]，當MDA水平升高時，提示產生的脂質氧化終產物增加，過氧化與抗氧化失衡，即發(fā)生氧化應激反應，可導致機體相關疾病發(fā)生。GSH是一種自由基清除劑，參與體內糖代謝及三羧酸循環(huán)，通過激活多種酶，促進蛋白質、糖及脂肪代謝[16]。機體內存在多種抗氧化物，清除體內產生的各種活性氧，從而阻止氧化應激的產生，T-AOC可以說是一個體系內的各種抗氧化大分子、小分子和酶的總水平[17]。臨床研究表明，實熱“上火”人群的血漿中MDA、GSH、T-AOC水平明顯升高[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，實熱證動物模型與臨床實熱“上火”人群血漿中MDA、GSH、T-AOC水平變化一致，均明顯升高，說明實熱“上火”與氧化應激反應密切相關，在實熱“上火”狀態(tài)時，體內產生脂質過氧化物MDA較正常時增加，提示已經發(fā)生過氧化反應，但同時GSH、T-AOC的升高說明機體動員自身抗氧化能力，試圖恢復機體的氧化平衡狀態(tài)。

血清內氧化應激水平的異常是否會引起血清代謝物的變化，本研究進一步探討了這個問題。本研究顯示模型大鼠體內溶血卵磷脂、皮甾酮和二十碳五烯酸等物質降低，同時導致棕櫚酸、鞘氨醇升高，說明熱證大鼠血清中的脂質代謝發(fā)生顯著變化，導致脂代謝和甾體激素生物合成異常。溶血卵磷脂,亦稱溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine），是卵磷脂被磷脂酶A水解生成的一種化合物[18]。鞘氨醇（sphingosine）是一種含有不飽和烴基鏈的十八碳氨基醇，為細胞膜組成成分之一，兩者都屬于磷脂質的一種，在細胞識別和信號轉導及調節(jié)細胞代謝上具有重要作用，與炎癥、免疫、過敏及心血管疾病等重要病理過程有關[19]。二十碳五烯酸是人體常用的幾種Ω-3脂肪酸之一。研究發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸能調節(jié)血脂，能有效地控制人體血脂的濃度，增加二十碳五烯酸的吸收，已被證實有利于治療冠狀動脈心臟病、高血壓，并對治療由自身免疫缺陷引起的炎癥有效[20-21]。皮甾酮（cortexolone）又名可托多松，屬于類固醇激素（即甾體激素），與可的松或氫化可的松這些類固醇激素類似,具有優(yōu)良的抗炎、抗過敏和免疫抑制作用[22]，皮甾酮的顯著降低提示體內抑制炎癥反應的能力被削弱。

知柏地黃湯是臨床使用經典的滋陰降火方藥，筆者前期研究中檢測知柏地黃湯對大鼠內環(huán)境的改變，發(fā)現(xiàn)知柏地黃湯造模的大鼠血液中棕櫚酸含量降低，一系列溶血性磷脂含量升高[23]。本文中紅參、黃芪誘導的大鼠實熱證模型血液中棕櫚酸含量升高，同時也伴有一系列溶血性磷脂含量降低。因此，血液中棕櫚酸和溶血性磷脂在實熱證發(fā)生過程的作用機制值得進一步探討。

氧化應激水平的增加與動脈粥樣硬化中的內皮功能受損有關，并在心血管疾病進程中起著重要作用。脂質代謝的穩(wěn)定在維持能量、免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，不飽和脂肪酸能降低膽固醇、甘油三酯水平，抑制炎性細胞因子誘導的內皮活化，減少內皮細胞遷移和增殖[24]，對血小板功能和動脈血栓有明顯影響。增加不飽和脂肪酸的含量可改善脂代謝紊亂、炎癥及氧化應激狀態(tài)，同時可改善內皮細胞功能[25]。本研究結果顯示實熱組大鼠血清氧化應激水平升高，不飽和脂肪酸二十碳五烯酸的含量顯著降低，提示熱證可能會加劇消耗不飽和脂肪酸，進而可能會增加人體氧化應激的程度，引起心血管系統(tǒng)的炎癥反應。以上提示熱性藥的長期使用或者長期處于實熱的狀態(tài)有增加心血管疾病的風險，臨床使用熱性藥進行治療時，要慎重考慮到時間及劑量的準確性。

綜上，實熱證可能跟機體的神經內分泌、能量代謝等有很大的關聯(lián)。本研究中采用了紅參、黃芪模擬中醫(yī)誘因疊加西醫(yī)病理復制的方法制備了實熱證大鼠模型。雖然從客觀指標來說該造模方法大體符合中醫(yī)實熱證的臨床表現(xiàn)，但是尚不能充分體現(xiàn)動物模型與原病證的相似性和典型性，與中醫(yī)臨床實熱證形成的病因還是存在著一定的差別。理想的中醫(yī)熱證模型必須符合中醫(yī)的特色，因此病證結合的造模方法是復制中醫(yī)證候動物模型的必經之路。在實熱證評價指標方面，研究指標雖然很多，但只能說明單一方面的問題，多種指標的內在聯(lián)系及如何與整體結合起來觀察還有待進一步探究。