劉衍素， 范艷珠， 方光戰(zhàn)*

(1.四川護(hù)理職業(yè)學(xué)院，成都610100； 2. 中國科學(xué)院成都生物研究所，成都610041)

全身麻醉是指藥物誘導(dǎo)下中樞神經(jīng)系統(tǒng)被抑制的狀態(tài)，該狀態(tài)能保證長時間的手術(shù)操作和有創(chuàng)實驗研究的順利進(jìn)行(Antogninietal.，2005；Goddard & Smith，2013)。全身麻醉以痛覺消失、靜止不動和意識喪失為特征，是麻醉藥品劑量和被麻醉對象意識狀態(tài)之間的平衡(Pocock & Richards，1993；Brownetal.，2010)。麻醉不充分可導(dǎo)致術(shù)中覺醒，而麻醉過量則增加并發(fā)癥風(fēng)險(Zhangetal.，2001；Loepke & Soriano，2008)。因此，精確的麻醉深度監(jiān)測對手術(shù)安全至關(guān)重要(Goddard & Smith，2013)。麻醉深度可用大腦活動的復(fù)雜度來刻畫(Bruhnetal.，2000；Zhangetal.，2001；Ferenetsetal.，2006；Liangetal.，2015；Hudetzetal.，2016)：清醒時復(fù)雜度最高，而麻醉時復(fù)雜度最低。研究發(fā)現(xiàn)，不同腦區(qū)的大腦活動復(fù)雜度變化不盡相同；同時，與其他腦區(qū)相比，中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、丘腦、頂葉聯(lián)合皮層和額葉聯(lián)合皮層等特定區(qū)域?qū)β樽硭幬锔鼮槊舾?Heinke & Koelsch，2005)。有研究認(rèn)為，丘腦-皮層環(huán)路(特別是丘腦)可能在麻醉-覺醒調(diào)控中起著重要的調(diào)節(jié)作用(Ries & Puil，1999；Franks，2008)，但是在麻醉-覺醒過程中，丘腦活動復(fù)雜度的動態(tài)變化特征依然不夠明確，同時尚不清楚丘腦是否為最重要的調(diào)控腦區(qū)。

大腦功能偏側(cè)性普遍存在于動物中(Rogers & Vallortigara，2008；Samara & Tsangaris，2011；Satoetal.，2011；Roussigneetal.，2012；Salvaetal.，2012；Frasnelli，2013；Rogersetal.，2013；Rogers，2014；Guoetal.，2016；薛飛等，2016)。當(dāng)信息傳入大腦時，偏側(cè)性可確保大腦左右半球并行處理信息，從而提高信息處理能力(Vallortigara & Rogers，2005；Daddaetal.，2009；Fangetal.，2014)?？梢?，偏側(cè)性具有適應(yīng)性意義，即通過提高動物感知信息和行為響應(yīng)的效率來提高適合度。意識是大腦功能之一，所以麻醉-覺醒的調(diào)控(即意識的保持與恢復(fù))可能亦存在偏側(cè)性，但需實驗證實。

腦電(electroencephalogram，EEG)是大量錐體細(xì)胞同步產(chǎn)生的突觸后電位總和在大腦皮層或頭皮表面的反映(Muthuswamyetal.，1996)。EEG是評估不同麻醉狀態(tài)下大腦活動情況最直接的方法，但是通過傳統(tǒng)的線性方法對原始EEG信號進(jìn)行分析得到的結(jié)果往往難以解釋大腦在不同麻醉狀態(tài)下的各種特征(Billardetal.，1997；Katohetal.，1998；Bruhnetal.，2006；Mahonetal.，2008)。大腦通常表現(xiàn)出非線性和混沌行為(Bruhnetal.，2000；Buriokaetal.，2005)，其特征可通過非線性參數(shù)加以描述；復(fù)雜度是眾多非線性參數(shù)中的一種，與事物的本質(zhì)特征有關(guān)，而與事物的大小、多少等物理量沒有必然聯(lián)系。Lempel-Ziv復(fù)雜度(Lempel-Ziv complexity，LZC)是用來度量信號復(fù)雜程度，算法簡單快速且能有效刻畫腦電信號復(fù)雜度的物理量(Zhangetal.，2001；Abásoloetal.，2015)，可用來研究大腦功能狀態(tài)及麻醉劑對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用(Schartneretal.，2015)。

從宏觀解剖結(jié)構(gòu)看，兩棲類動物的大腦與爬行類、鳥類和哺乳類(含人類)相似，均分為端腦、間腦、中腦、后腦和延髓等部分(Wilczynski & Endepols，2007)，其間腦由背側(cè)的丘腦和腹側(cè)的下丘腦組成，且直接位于顱骨下方，而不像其他高等動物被大腦皮層覆蓋。這樣的結(jié)構(gòu)有利于電極植入，更有利于采集到高信噪比的丘腦活動信號。非洲爪蟾Xenopuslaevis是兩棲類中應(yīng)用最廣的動物模型，在發(fā)育、遺傳和神經(jīng)系統(tǒng)功能等研究領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用(Kay & Peng，1991；Schultz & Dawson，2003；Guénetteetal.，2013)。魚安定(triciane methanesulfonate，MS-222)是一種安全有效的水溶性麻醉劑，常用于魚類和蛙類等變溫動物的麻醉。

本研究以非洲爪蟾為對象，在其端腦、間腦、中腦左右兩側(cè)分別埋植電極，通過MS-222麻醉，連續(xù)記錄動物在“麻醉前清醒-給藥-恢復(fù)-麻醉后清醒”整個過程中的EEG信號。通過計算不同時期各腦區(qū)的LZC，探討麻醉-覺醒過程中大腦活動復(fù)雜度的動態(tài)特征，及可能存在的麻醉-覺醒調(diào)控偏側(cè)性。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物

以14只成年非洲爪蟾(雌雄各半)為研究對象，按性別飼養(yǎng)于2個透明玻璃缸(長120 cm×寬50 cm×高60 cm)中，水深20 cm。每周投食、換水1次。養(yǎng)殖房室溫20 ℃±1 ℃，光周期12L∶12D(08∶00開燈)。手術(shù)時動物體長為8.1 cm±1.1 cm、體質(zhì)量為67.1 g±22.2 g。所有手術(shù)及實驗流程均符合中國科學(xué)院成都生物研究所動物福利倫理委員會的相關(guān)要求。

1.2 動物手術(shù)

將動物浸入3.5 g·L-1MS-222溶液中進(jìn)行麻醉，通過夾趾反應(yīng)判斷麻醉程度，無夾趾反應(yīng)時立即停止麻醉。局部消毒，去除手術(shù)區(qū)皮膚，剝離頭骨表面肌肉暴露頭骨。根據(jù)圖1所示坐標(biāo)，分別在左右端腦(LT和RT)、左右間腦(LD和RD)、左右中腦(LM和RM)埋植不銹鋼電極(φ=0.8 mm)，參考電極埋植在小腦上方(P)。LT和RT位于人字縫前方6.4 mm，旁開1 mm；LD和RD位于人字縫前方3.4 mm，旁開1 mm；LM和RM位于人字縫前方1.4 mm，旁開1 mm；P位于人字縫中線后1 mm處。電極擰入顱骨深度約1 mm，再用牙托水泥固定并覆蓋整個手術(shù)創(chuàng)口，用局部消炎止痛藥膏均勻涂抹創(chuàng)口。最后用自封膜包裹電極接插件以防水。術(shù)后，動物置于水深約10 cm的塑料盒中單獨飼養(yǎng)，休息1 d后進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

圖1 電極位置分布及相應(yīng)的10 s腦電特征波形Fig. 1 Electrode placements and corresponding typical electroencephalogram tracings of 10 s

LT.左端腦， RT. 右端腦， LD. 左間腦， RD. 右間腦， LM. 左中腦， RM. 右中腦， P. 小腦上方； 下同

LT and RT. the left and right telencephalon， LD and RD. the left and right diencephalon， LM and RM. the left and right mesencephalon， P. above the cerebellum； the same below

1.3 數(shù)據(jù)采集

在電磁屏蔽的隔音室(背景噪音24.3 dB±0.7 dB)內(nèi)進(jìn)行實驗。將動物放在透明實驗盒(底面積18 cm×11 cm，開口處20 cm×13 cm，高12 cm)內(nèi)吸滿水的海綿(厚度為1 cm、吸水量約150 mL)上，以保證動物皮膚濕潤，實驗盒上方加通氣透明的蓋子。光照和溫度與養(yǎng)殖房一致。在實驗盒上方約40 cm處安裝具有運動偵測功能的紅外攝像機，記錄動物運動行為。

實驗開始前，將動物連接至信號采集系統(tǒng)(RM6280，成都儀器廠)，并設(shè)定采樣頻率為1 000 Hz，記錄動物麻醉-覺醒周期的EEG和行為數(shù)據(jù)：(1)麻醉前清醒期(Stage Ⅰ)：記錄EEG 30 min，此時動物頭部通常朝向?qū)嶒灪幸唤遣⒈３植粍樱?2)給藥期(Stage Ⅱ)：從將動物換入裝有200 mL 3.5 g·L-1MS-222溶液的、與實驗盒同規(guī)格的塑料盒中進(jìn)行麻醉開始，至無夾趾反應(yīng)止；(3)恢復(fù)期(Stage Ⅲ)：從將動物放入原記錄盒開始，至輕觸即出現(xiàn)自主運動止；(4)麻醉后清醒期(Stage Ⅳ)：恢復(fù)期后連續(xù)記錄30 min。實驗結(jié)束后，通過過量麻醉對動物進(jìn)行安樂死，并在電極的相應(yīng)位點注射蘇木精染料，檢查電極位置是否與預(yù)期一致。

1.4 LZC

LZC是由Lempel和Ziv(1976)提出的一種時間序列復(fù)雜性測度分析方法，即先對時間序列進(jìn)行符號化(粗粒化)處理后，通過計算其符號序列出現(xiàn)新模式的概率來表征時間序列的復(fù)雜度。計算步驟為：

(1)對時間序列進(jìn)行符號化(粗粒化)處理：對于時間序列xt(t=1，2，3，…，n)，根據(jù)選取的閾值(大于閾值時取1，否則取0)，將其轉(zhuǎn)化成(0，1)符號序列，即St(t=1，2，3，…，n)。

(2)令St(t=1，2，3，…，n)和Qt(t=1，2，3，…，m)為2個由(0，1)序列組成的字符串；SQ表示S和Q 2個字符串的級聯(lián)，即SQ={S1，S2，…，Sn，Q1，Q2，…，Qm}；SQπ表示把SQ中最后一個字符刪去后所得的字符串，即SQπ=(S1，S2，…，Sn，Q1，Q2，…，Qm-1}。令V(SQπ)表示SQπ中所有不同子串的集合，并設(shè)C(n)為符號序列St的復(fù)雜度。

(3)初始化：令C(n)=1，S={S1}，Q={S2}，則SQπ={S1}。

(5)重復(fù)步驟(4)，直到待求序列中所有的字符被取完。這樣就把符號序列St(t=1，2，3，…，n)分成了C(n)個不同的子串，即得到復(fù)雜度。

由于對任意足夠長的序列，進(jìn)行二進(jìn)制符號化后所得的符號序列的復(fù)雜度趨向定值：

因此，復(fù)雜度可歸一化為：LZC=C(n)/b(n)。LZC值為0～1，反映時間序列的復(fù)雜程度。LZC值越小，說明時間序列的規(guī)律性越明顯；LZC值越大，則表示其復(fù)雜性越高，說明出現(xiàn)新模式的概率越高，即隨機性越強。

1.5 數(shù)據(jù)處理

EEG信號經(jīng)50 Hz陷波、0.5～45 Hz帶通濾波和256 Hz降采樣后，以2 s為長度對數(shù)據(jù)進(jìn)行分段。若數(shù)據(jù)最大幅度大于100 μV，即視為偽跡剔除；由于中值對奇異值不敏感，所以對無偽跡數(shù)據(jù)段，取其中值為閾值對數(shù)據(jù)進(jìn)行符號化(Abásoloetal.，2015)；然后計算每段的LZC值；最后每只動物按時段和腦區(qū)對LZC值進(jìn)行平均。后續(xù)統(tǒng)計分析均基于上述均值。

1.6 統(tǒng)計分析

用Shapiro-WilkW檢驗和Levene’s檢驗對LZC值進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗，采用三因素(時段、腦區(qū)和性別)重復(fù)測量ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析，同時檢測主效應(yīng)和交互效應(yīng)。必要時使用Greehouse-Geisser校正；若存在交互效應(yīng)則進(jìn)行簡單效應(yīng)分析。利用最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行事后檢驗；效應(yīng)度通過partialη2估計。利用Pearson相關(guān)分析計算各時段LZC值與給藥時長的相關(guān)性。所有統(tǒng)計在SPSS 21.0中完成，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

在麻醉-覺醒過程中，不同腦區(qū)腦電LZC值的動態(tài)變化見圖2，在清醒階段(Stages Ⅰ/Ⅳ)，LZC值最大；給藥時，LZC值急劇下降到最小；恢復(fù)時，LZC值逐漸上升。

2.1 LZC值的統(tǒng)計結(jié)果

ANOVA分析結(jié)果顯示(表1)，時段[F(2， 24)=20.802，partialη2=0.634，P<0.001]和腦區(qū)[F(5， 60)=21.115，ε=0.547，partialη2=0.638，P<0.001]的主效應(yīng)極顯著，而性別[F(1， 12)=4.342，partialη2=0.266，P=0.059]無主效應(yīng)，且時段和腦區(qū)交互效應(yīng)顯著[F(10， 120)=3.506，ε=0.394，partialη2=0.226，P=0.014]。

簡單效應(yīng)分析顯示(表2)，麻醉-覺醒周期中左端腦的LZC值最大，并且清醒階段(Stages Ⅰ/Ⅳ)端腦的LZC值極顯著大于間腦[Stage Ⅰ：F(5， 65)=36.252，ε=0.434，partialη2=0.736，P<0.001；Stage Ⅳ：F(5， 65)=8.668，partialη2=0.400，P<0.001]，但在恢復(fù)階段，它們的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對于每個腦區(qū)而言，清醒階段的LZC值均極顯著大于恢復(fù)階段[左端腦：F(2， 26)=17.695，partialη2=0.576，P<0.001；右端腦：F(2， 26)=20.450，partialη2=0.611，P<0.001；左間腦：F(2， 26)=13.502，partialη2=0.509，P<0.001；右間腦：F(2， 26)=12.980，partialη2=0.500，P<0.001；左中腦：F(2， 26)=8.616，partialη2=0.399，P=0.001；右中腦：F(2， 26)=16.977，partialη2=0.566，P<0.001]。

2.2 LZC相關(guān)性分析結(jié)果

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在右端腦(r=0.665，P=0.009)和右間腦(r=0.625，P=0.017)，Stage Ⅰ的LZC值與給藥時長顯著正相關(guān)；在右間腦(r=-0.542，P=0.045)，Stage Ⅳ的LZC值與給藥時長顯著負(fù)相關(guān)(表3)。

圖2 在麻醉-覺醒過程中非洲爪蟾不同腦區(qū)的腦電Lempel-Ziv復(fù)雜度Fig. 2 Lempel-Ziv complexity for different brain regions during the anesthesia-awakening cycle of Xenopus laevis

Ⅰ. 麻醉前清醒期， Ⅱ. 給藥期， Ⅲ. 恢復(fù)期， Ⅳ. 麻醉后清醒期； 下同

Ⅰ. Stage Ⅰ (pre-anesthesia stage)， Ⅱ. Stage Ⅱ (administration stage)， Ⅲ. StageⅢ (recovery stage)， Ⅳ. Stage Ⅳ (post-anesthesia stage)； the same below

表1 Lempel-Ziv復(fù)雜度的ANOVA統(tǒng)計結(jié)果

注： >表示其左側(cè)相應(yīng)條件下的LZC值大于右側(cè)， 同側(cè)內(nèi)無差異； NA. 不適用； 下同

Notes： > denotes that Lempel-Ziv complexity values for the given conditions on the left side are significantly larger than those on the right side， and no significant difference exists among the corresponding conditions on the same side； NA. not applicable； the same below

表2 Lempel-Ziv復(fù)雜度的簡單效應(yīng)分析Table 2 Simple effects analysis for Lempel-Ziv complexity

表3 Lempel-Ziv復(fù)雜度與給藥時長的相關(guān)性Table 3 Correlation analysis between Lempel-Ziv complexity and the duration of administration stage

3 討論

3.1 LZC隨麻醉-覺醒周期動態(tài)變化

通過計算非洲爪蟾“麻醉前清醒-給藥-恢復(fù)-麻醉后清醒”整個周期中EEG信號的LZC值，發(fā)現(xiàn)全身麻醉能引起其顯著改變：在麻醉前清醒期，LZC值處于較高水平；給藥時，LZC值驟降；當(dāng)動物處于深度麻醉時，LZC值最??；恢復(fù)階段，LZC值逐漸恢復(fù)到原始清醒狀態(tài)時的水平。這種大腦復(fù)雜度隨著麻醉-覺醒周期動態(tài)變化的結(jié)果與非洲爪蟾在麻醉-覺醒過程中EEG信號的熵的動態(tài)變化相似(Fanetal.，2018)，同時與人類病人在全身麻醉時大腦復(fù)雜度的動態(tài)變化類似(Bruhnetal.，2000)，表明利用LZC值可以較好地刻畫麻醉-覺醒周期大腦的動態(tài)變化和測量麻醉深度(Zhangetal.，2001；Fanetal.，2011；Schartneretal.，2015；Hudetzetal.，2016)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，清醒期(麻醉前和麻醉后)的LZC值顯著高于恢復(fù)期。LZC值越大，表明大腦系統(tǒng)復(fù)雜度越高，EEG信號更難預(yù)測；相反，LZC值越小，表明大腦系統(tǒng)復(fù)雜度越低，EEG信號變化具有更強的規(guī)律性和可預(yù)測性。清醒期LZC值的高水平與此時動物需不停采集外界信息并進(jìn)行分析處理的功能需求一致(Heinke & Koelsch，2005)；而在恢復(fù)期，大腦意識喪失，對外界刺激無響應(yīng)，此時LZC值較低。由此可見，LZC值的變化與動物大腦功能狀態(tài)的改變相對應(yīng)，說明此方法適用于麻醉深度和大腦活動復(fù)雜度的監(jiān)測。

3.2 右側(cè)丘腦在麻醉-覺醒調(diào)控中可能起著關(guān)鍵作用

相關(guān)性分析顯示，右端腦和右間腦(丘腦)在麻醉前清醒期的LZC值與給藥時長正相關(guān)，說明右端腦和右側(cè)丘腦在麻醉前清醒期越活躍，進(jìn)入全身麻醉狀態(tài)所需的時間就越長，這一結(jié)果與用近似熵和排列熵的分析結(jié)果類似(Fanetal.，2018)。另外，右側(cè)丘腦在麻醉后清醒期的LZC值與給藥時長呈負(fù)相關(guān)，說明給藥時長越短，右側(cè)丘腦在麻醉后清醒期就越活躍；反之，給藥時間越長，右側(cè)丘腦就越處于抑制狀態(tài)。由于LZC值和給藥時長的相關(guān)性主要出現(xiàn)在右側(cè)丘腦，而且和清醒期相比，恢復(fù)期丘腦與端腦之間的LZC值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明右側(cè)丘腦在麻醉-覺醒調(diào)控中可能起著重要作用。這一推論與既往的研究結(jié)果一致：首先，脊椎動物不同腦區(qū)對麻醉劑的敏感程度不同(Heinke & Koelsch，2005)；其次，大腦皮層、邊緣系統(tǒng)和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及皮層-丘腦環(huán)路在意識調(diào)控過程中起著關(guān)鍵作用(Heinke & Schwarzbauer，2002；Heinke & Koelsch，2005)，而丘腦是多種感覺信息投射到端腦的中繼站(Sherman & Guillery，2002；Béhuretetal.，2013)，全身麻醉導(dǎo)致的無意識狀態(tài)通常伴隨著丘腦代謝或血流減少，提示丘腦起著意識開關(guān)的作用(Alkireetal.，1997；Fisetetal.，1999)。當(dāng)前結(jié)果進(jìn)一步提示，右側(cè)丘腦在麻醉-覺醒調(diào)控中可能起著更為重要的作用，即這種調(diào)控具有偏側(cè)性，這一結(jié)論與包括人在內(nèi)的所有脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)都具有結(jié)構(gòu)和功能偏側(cè)性這一事實相符(Fangetal.，2014；Rogers，2014；薛飛等，2016；Vallortigara & Versace，2017)?？傮w上，端腦的LZC值最大，這與蛙類端腦具有高級認(rèn)知和信息處理的功能相匹配(Fangetal.，2015；Xueetal.，2016a，2016b；Yueetal.，2017)。