朱未， 朱磊， 何凡， 付磊， 帥素蓉， 江建平*

(1. 中國科學(xué)院成都生物研究所，成都610041； 2. 四川中測環(huán)境技術(shù)有限公司，成都611731； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都611130)

豬Susscrofadomesticus在解剖學(xué)、生理學(xué)、疾病發(fā)生機理方面和人Homosapiens極其相似(任麗華，2006)，是人類疾病研究的潛力模型。小型豬的一般生物學(xué)特征與普通家豬基本相同，但其具有養(yǎng)殖成本低、便于實驗操作、節(jié)約試劑與受試物等突出優(yōu)勢，目前已被廣泛用于人類疾病模型構(gòu)建、藥理毒理學(xué)研究以及新藥與化妝品評價等方面(Bronneretal.，2002；Garthoffetal.，2002；Ryskaetal.，2004；Sebertetal.，2005；Turketal.，2005；Imaietal.，2006；袁進，顧為望，2011)。目前，我國小型豬資源和品種主要有版納微型豬、五指山豬、廣西巴馬小型豬、貴州香豬、滇南小耳豬、藏豬等(李群，2008)。其中，藏豬是我國唯一的高原高寒型放牧豬種，環(huán)境適應(yīng)力強、抗病性高、飼養(yǎng)成本低，6月齡體質(zhì)量約20 kg(何凡等，2013)，適用于藥物代謝實驗，因而具有重要的經(jīng)濟價值和科研價值。在此基礎(chǔ)上，進一步選育抗病能力強、生長發(fā)育穩(wěn)定、小型化的品系具有良好的應(yīng)用前景，而篩選可以作為標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)的遺傳標(biāo)記無疑是實現(xiàn)這一目標(biāo)的重要手段。

研究表明，豬的白細胞抗原復(fù)合體(swine leukocyte antigen，SLA)基因多態(tài)性不僅影響豬對疾病的抵抗能力，還與個體生長發(fā)育、繁殖性能、胴體品質(zhì)以及肉質(zhì)等性狀有關(guān)(Gautschi & Gaillard，1990；Mallardetal.，1991；彭勇波等，2005)。SLA基因主要分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三大類，其中，SLAⅡ類基因位于SLA-D區(qū)，控制機體的免疫應(yīng)答與調(diào)控，在調(diào)節(jié)機體抗病能力方面起到非常重要的作用。SLAⅡ類基因包括DPA、DPB、DMA、DMB、DOA、DOB、DQA、DQB、DRA和DRB等，但僅SLA-DQ及SLA-DR基因能編碼蛋白質(zhì)(Shiaetal.，1991，1995)。SLA-DRB基因包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，其產(chǎn)物由237個氨基酸殘基組成(Gustafssonetal.，1990a，1990b)。吳圣龍等(2007)對蘇太豬SLA-DQB和SLA-DRB基因外顯子多態(tài)性及其與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，組合基因型BBDF的第3胎繁殖性能(總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、初生窩重和斷奶仔豬數(shù))顯著高于組合基因型AADD、AADF、ABDD和CCDF。張冬杰(2010)對黑龍江野豬與北京黑豬雜交的F1代個體的研究發(fā)現(xiàn)，SLA-DRB基因經(jīng)BcnⅠ和MboⅠ酶切后產(chǎn)生BB型和AB型的個體，其仔豬的初生質(zhì)量更大。這些研究結(jié)果表明，SLA-DRB基因的多態(tài)性在豬種的選育方面具有重要參考價值。

本文檢測了近親選配的阿壩藏豬SLA-DRB基因部分內(nèi)含子3、外顯子4、內(nèi)含子4、外顯子5共1 220 bp序列，分析了其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點多態(tài)性及其與生長發(fā)育性狀的相關(guān)性，以篩選可以用于藏豬早期篩選的MAS遺傳標(biāo)記。這將為藏豬的選育、資源評價、利用及保護提供理論依據(jù)，促進藏豬實驗動物化的研發(fā)工作。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗的藏豬是引自四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣的1雄2雌全同胞藏豬的后代(F4～F6)，飼養(yǎng)于四川省蒲江縣復(fù)興鎮(zhèn)。雌雄藏豬分圈飼養(yǎng)，每圈2頭，按日齡供料，每日09∶00和17∶00各飼喂1次，自動飲水器喂水。

1.2 性狀測定

共測定89頭藏豬(45雄44雌)不同月齡的體高、體長、頭長、最大額寬、頭深、尻高(薦部最高點至地面的垂直距離)、尻長(腰角前緣到臀端后緣的直線距離)、腰角寬、胸深、胸寬、胸圍、腹圍、管圍(左前肢前臂骨上三分之一處的水平周徑)和體質(zhì)量共14項指標(biāo)，具體測量標(biāo)準(zhǔn)參考何凡(2013)。體質(zhì)量精確到0.05 kg，其他指標(biāo)精確到0.2 cm。所有被測豬體尺均在喂食2 h后實地測定，體質(zhì)量在早上飼喂前稱量。管圍率為管圍除以其他體尺指標(biāo)后所得的衍生指標(biāo)。

1.3 SLA-DRB基因序列獲取

取約25 mg耳組織樣品，切碎后置于無菌的1.5 mL離心管中，細胞組織DNA提取試劑盒(TransGen Biotech，北京)提取DNA，通用型DNA純化回收試劑盒(天根生化科技，北京)純化組織DNA。

參照SLA-DRB基因序列(GenBank登錄號：AY303991)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計PCR擴增引物，主要擴增區(qū)域為該基因的部分內(nèi)含子3、外顯子4、內(nèi)含子4、外顯子5，擴增片段長度為1 220 bp。上游引物序列為SLA-DRBF：5’-ACCCACTGAGCG-AGGGAAGGGATTG-3’，下游引物序列為SLA-DRBR：5’-GGAGGACGCAGAGCATAGCAGGAGC-3’。

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Mix 12 μL，上、下游引物各0.7 μL(10 pmol·μL-1)，DNA模板1.6 μL(50 ng·μL-1)，ddH2O 10 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性35 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠后用試劑盒純化，純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司和北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用DNAStar中的MegAlign對測序獲得的所有SLA-DRB基因序列進行比對，檢測SNP位點。基于所有SLA-DRB基因序列計算其基因頻率、基因型頻率，并進行Hardy-Weinberg平衡卡方適合性檢驗(王鐵崗，2009)，計算位點純合度(Ho)、位點雜合度(He)、有效等位基因(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)(Nei，1978)。參照Shi和He(2005)的方法，利用SHEsis(http：//analysis2.bio-x.cn/myAnalysis.php)對SLA-DRB基因的SNP位點進行連鎖不平衡分析，并根據(jù)連鎖強度將各SNP位點分組，每組含1到多個SNP位點。對于僅含1個SNP的位點組(即獨立SNP)，利用Matlab的多因素方差分析評價該位點的單體型組合和日齡與各體尺指標(biāo)的關(guān)聯(lián)；對于含有2個及以上的SNP位點組，參照黃萌和蔡琳(2009)的方法，利用PHASE 2.1分析其在該藏豬群體中存在的單體型、單體型組合及各自頻率，然后利用Matlab的多因素方差分析評價該位點組的單體型組合和日齡與各體尺指標(biāo)的關(guān)聯(lián)；合并兩部分的分析結(jié)果，并用BHFDR對P值進行矯正。

2 結(jié)果

2.1 SNP位點的識別

共獲得89頭個體的SLA-DRB基因序列，通過序列比對發(fā)現(xiàn)存在14個SNP位點(圖1)，其中，6個突變位于內(nèi)含子3，分別為g.11369 C>G、g.11387 A>G、g.11440 C>T、g.11468 C>T、g.11470 A>G、g.11478 C>T；1個突變位于外顯子4(g.11532 A>G)；7個突變位于內(nèi)含子4，分別為g.11708 C>T、g.11829 A>G、g.11838 C>T、g.11911 T>G、g.11944 C>G、g.11945 A>G、g.11997 C>T；外顯子5無突變。

2.2 SLA-DRB基因遺傳結(jié)構(gòu)分析

遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(表1)表明，位點g.11369、g.11387、g.11470、g.11478、g.11532、g.11829、g.11838、g.11944、g.11945、g.11997處于中度多態(tài)(0.25G使原始密碼子GGA突變?yōu)镚GG，均編碼甘氨酸，屬同義突變?？ǚ竭m合性檢驗顯示，除位點g.11468處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)外，其余13個SNP位點均處于不平衡狀態(tài)，即均受到選擇壓的影響。

2.3 SLA-DRB基因位點連鎖分析及單體型分析

根據(jù)連鎖不平衡分析的定義，2個位點間的r2≥0.33，即2個位點處于強連鎖狀態(tài)。對SLA-DRB基因的14個SNP位點進行連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)所有位點均存在直接或間接的強連鎖關(guān)系(圖2)。以14個SNP位點識別單體型，發(fā)現(xiàn)89頭豬共有27種單體型，30種單體型組合。

圖1 藏豬SLA-DRB 基因14個單核苷酸多態(tài)性位點(箭頭所指)Fig. 1 14 loci of single nucleotide polymorphisms of SLA-DRB gene in Tibetan pigs (arrows)

通過提高強連鎖的標(biāo)準(zhǔn)(r2)，發(fā)現(xiàn)g.11468、g.11440、g.11478與g.11944各自與其他位點的關(guān)聯(lián)性相對較低；g.11911與g.11708間的關(guān)聯(lián)性高，而與其他位點的關(guān)聯(lián)性低；g.11470、g.11945、g.11997、g.11387、g.11369與g.11829兩兩間的關(guān)聯(lián)性高；g.11532與g.11838兩者間的關(guān)聯(lián)性高(圖2)。因此，將g.11470、g.11945、g.11997、g.11387、g.11369與g.11829歸為緊密相關(guān)的SNP位點，定義為組合1；g.11532與g.11838歸為緊密相關(guān)的SNP位點，定義為組合2；g.11911與g.11708歸為緊密相關(guān)的SNP位點，定義為組合3。在此基礎(chǔ)上，將所有樣本的序列重新劃分單體型(表2)：組合1共有11種單體型(H11～H111)和12種單體型組合(H11H11=35、H111H111=37、H11H111=4、H11H51=3、H11H41=3、H31H51=1、H91H111=1、H71H111=1、H61H101=1，H71H81=1、H11H61=1、H21H111=1)；組合2共有4種單體型(H12～H42)和5種單體型組合(H42H42=48、H12H12=26、H12H42=9、H12H22=5、H12H32=1)；組合3共有2種單體型(H13、H23)和3種單體型組合(H13H13=73、H23H23=12、H13H23=4)。

2.4 SLA-DRB基因單體型與生長發(fā)育性狀的關(guān)聯(lián)分析

性別、各位點頻次大于3的單體型組合與生長發(fā)育性狀的關(guān)系分析結(jié)果(圖3)表明：性別與腹圍、體質(zhì)量、胸寬、胸深、胸圍和腰角寬的相關(guān)性顯著，雌性較雄性大。g.11944和g.11440的位點多態(tài)性與所有體尺指標(biāo)的相關(guān)性均不顯著；g.11478的位點多態(tài)性與管圍、尻高、體長和頭長的相關(guān)性顯著，單體型組合為C/T的個體具有較小的管圍、尻高、體長和頭長；g.11468的位點多態(tài)性與管圍顯著相關(guān)。組合3的位點多態(tài)性與除尻高、體質(zhì)量和頭長以外的所有體尺指標(biāo)顯著相關(guān)，這些體尺指標(biāo)在單體型組合為TT/CG(H13H23)的個體中均偏小。組合2的位點多態(tài)性與管圍、尻長和胸圍的相關(guān)性顯著，其中，單體型組合為AC/AT(H12H22)的個體有較小的尻長和胸圍。組合1的位點多態(tài)性與管圍、尻長、體高和胸深顯著相關(guān)，其中，單體型組合為CAAGGT/CAGAAT(H11H41)的個體有較小的管圍、尻長、體高和胸深。

圖2 單核苷酸多態(tài)性位點間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)(基于r2值的連鎖不平衡分析)Fig. 2 Network between the loci of single nucleotide polymorphisms (linkage disequilibrium analysis based on r2 value)

編號ID單體型Haplotype位點Locusg.11369g.11387g.11470g.11532g.11708g.11829g.11838g.11911g.11945g.11997頻次FrequencyH11CAAGGTCAA——G——GT81H21CAAAGTCAA——A——GT1H31CAGGGTCAG——G——GT1H41CAGAATCAG——A——AT3H51CAGAACCAG——A——AC4H61CGGAACCGG——A——AC2H71GAAGGTGAA——G——GT2H81GAGAACGAG——A——AC1H91GGAAGTGGA——A——GT1H101GGAAGCGGA——A——GC1H111GGGAACGGG——A——AC81H12AC———A——C———67H22AT———A——T———5H32GC———G——C———1H42GT———G——T———105H13TT————T——T——150H23CG————C——G——28

管圍受SLA-DRB基因單體型的影響最突出，共與5個位點存在關(guān)聯(lián)(圖3)，且g.11478、g.11468、組合1和組合2與管圍存在極顯著的關(guān)聯(lián)(FDR<0.001)。g.11478的單體型組合為C/C、g.11468的單體型組合為C/C、組合1的單體型組合為GGGAAC/GGGAAC(H111H111)和組合2的單體型組合為GT/GT(H42H42)的個體具有更大的管圍(圖4)。

2.5 SLA-DRB基因單體型與管圍率的關(guān)聯(lián)分析

單體型組合與管圍率間關(guān)系的分析結(jié)果(圖5)表明：g.11478、g.11468、組合1和組合2的位點多態(tài)性與基于額寬、腹圍、尻高、體長、體高、頭長、頭深、胸寬、胸深、胸圍和腰角寬的管圍率均存在極顯著的關(guān)聯(lián)(FDR<0.001)，提示這些位點多態(tài)性與藏豬的管圍密切相關(guān)。與這些位點多態(tài)性關(guān)聯(lián)最緊密的是基于體高的管圍率，其中，g.11478的單體型組合為C/C、g.11468的單體型組合為C/C、組合1的單體型組合為GGGAAC/GGGAAC(H111H111)和組合2的單體型組合為GT/GT(H42H42)的個體有更大的管圍率(圖6)，與管圍的結(jié)果一致，提示其可以有效反映個體的體型、健康狀況?；谄渌L度指標(biāo)的管圍率大致具有相同的趨勢。與基于長度指標(biāo)的管圍率不同，基于體質(zhì)量的管圍率與g.11478、g.11468、組合1和組合2的位點多態(tài)性無顯著相關(guān)性。

3 討論

為了推進藏豬實驗動物化的培育工作，本課題組從四川省阿壩藏族羌族自治州引入全同胞藏豬，在四川省蒲江縣進行近親繁育，早期的研究工作探討了垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子(pituitary specific transcription factor-1，POU1F1)第4內(nèi)含子SNP位點多態(tài)性對該藏豬種群生長狀況的影響，發(fā)現(xiàn)POU1F1基因的g.13952A、g.14192T、g.14384G、g.14464T位點分別為A/A、T/T、G/G和T/T的個體在所測個體中生長最緩慢，提示POU1F1基因?qū)υ摬刎i群體的小型化篩選具有指導(dǎo)價值(何凡等，2013)。

本文進一步研究了該群體中SLA-DRB基因部分序列(部分內(nèi)含子3、外顯子4、內(nèi)含子4、外顯子5)的多態(tài)性，共發(fā)現(xiàn)了14個SNP位點。根據(jù)這些位點的連鎖相關(guān)性，共識別出3個組合和4個單一位點。分析表明，不同位點組合/單一位點與藏豬個體生長發(fā)育性狀間相關(guān)的程度不同。

圖3 單體型組合與各體尺指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析Fig. 3 Association analysis between haplotype combination and growth traits

每一方格的顏色代表-log10轉(zhuǎn)換的P值， 顏色越深代表該值越大， 即FDR值越小， 該組合與該體尺指標(biāo)的關(guān)聯(lián)越顯著； *** FDR<0.001， ** FDR<0.01， * FDR<0.05； 方格中標(biāo)注的單體型組合的含義為在這一多態(tài)性位點上擁有該單體型組合的個體， 其對應(yīng)的體尺指標(biāo)最?。?下同

The color of tiles stands for -log10transformedPvalue， the darker， the bigger， then FDR value is smaller； *** FDR<0.001， ** FDR<0.01， * FDR<0.05； individuals with haplotype combinations labelled on a certain tile tend to have smaller corresponding growth trait； the same below

圖5 單體型組合與管圍率的關(guān)聯(lián)分析Fig. 5 Association analysis between haplotype combination and the ratio of cannon bone circumference (CBC) to other growth traits

方格中標(biāo)注了2種單體型組合， 具有上排單體型組合的個體的管圍率偏大， 具有下排單體型組合的個體的管圍率偏??； M. 雄性， F. 雌性

Two types of haplotype combinations were labelled in tiles， individuals with the upper haplotype combinations tend to have larger ratio of CBC to corresponding growth trait， while those with lower haplotype combinations tend to have smaller ratio of CBC to corresponding growth trait； M. male， F. female

圖6 單體型組合與基于體高的管圍率的關(guān)聯(lián)Fig. 6 Association between haplotype combination and the ratio of cannon bone circumference to the body height

3.1 SLA-DRB基因SNP位點多態(tài)性與個體生長發(fā)育的關(guān)系

已有研究表明，SLA-DRB基因SNP位點多態(tài)性與豬的繁殖性能(總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、初生窩重、斷奶仔豬數(shù)等)密切相關(guān)(吳圣龍等，2007；張冬杰，2010)。本研究結(jié)果表明，SLA-DRB基因與藏豬個體的生長發(fā)育速率亦存在關(guān)聯(lián)。其中，組合3與藏豬的發(fā)育速率最相關(guān)，影響個體的額寬、腹圍、管圍、尻長、體長、體高、頭深、胸寬、胸深、胸圍、腰角寬等體尺指標(biāo)。值得注意的是，具有H13H23(TT/CG)單體型組合個體的上述所有指標(biāo)均最小，意味著該基因型的個體生長較為緩慢，整體體型偏小。組合H13H13與H23H23個體間的體尺指標(biāo)差異不大，對小型化藏豬個體的篩選意義有限。除組合3以外，組合1和g.11478分別與體高和體長相關(guān)聯(lián)，具有單體型組合H11H41(CAAGGT/CAGAAT)的個體具有較小的體高，而g.11478的單體型組合為C/T的個體具有較小的體長。表明SLA-DRB基因SNP位點多態(tài)性與藏豬個體生長趨勢存在顯著關(guān)聯(lián)，提示其可作為潛在的MAS遺傳標(biāo)記候選基因應(yīng)用于特定生長趨勢藏豬品系的篩選。

3.2 SLA-DRB基因SNP位點與管圍的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)，與SLA-DRB基因SNP位點多態(tài)性最為相關(guān)的藏豬體尺指標(biāo)為管圍。管圍與管骨的粗細密切相關(guān)，而管骨為長骨，其內(nèi)具有豐富的骨髓。脊椎動物骨髓內(nèi)含有豐富的間充質(zhì)干細胞，屬于多能干細胞，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、骨髓脂肪細胞和beta-胰島細胞等(Ankrumetal.，2014)。管圍和管圍率較大的藏豬個體理應(yīng)具有較多的管骨骨髓，因而可能在骨發(fā)育、心肌功能等方面更具優(yōu)越性。除此以外，骨髓更是淋巴系統(tǒng)的重要組成部分，是造血組織細胞分裂分化為淋巴細胞的重要場所，與胸腺共同完成淋巴細胞的產(chǎn)生和早期選擇(Yoffey，1975)。SLA基因作為豬的主要組織相容性復(fù)合體基因，在淋巴細胞的產(chǎn)生和選擇過程中發(fā)揮著重要作用(Nakayama，2015)。研究結(jié)果表明，管圍與SLA-DRB基因多態(tài)性之間存在極顯著的關(guān)聯(lián)，這與SLA-DRB基因在免疫系統(tǒng)中所扮演的角色相符合。因此，下一步的研究應(yīng)著力于證實管圍與管骨骨髓含量、淋巴血細胞造血能力以及個體免疫能力之間的關(guān)聯(lián)性，為基于SLA-DRB基因的MAS遺傳標(biāo)記開發(fā)提供完善的理論依據(jù)。

除潛在的免疫力指示作用以外，管圍及管圍率直接影響藏豬的體型。研究表明，馬的管圍率(管圍/體高)與其速度、步態(tài)特征具有顯著關(guān)聯(lián)，管圍率大的個體奔跑速率較低(李敏等，2014a，2014b)，藏豬可能存在類似的關(guān)聯(lián)。另外，豬的管圍是肉豬市場的重要選擇指標(biāo)，因為管圍可能與生長速率、性成熟時間等因素相關(guān)(Myersetal.，2012)。因此，管圍在培育實驗動物豬、寵物豬、娛樂豬和食用豬等方面均具有重要參考價值。而SLA-DRB基因與管圍之間的顯著關(guān)聯(lián)則為早期遺傳輔助篩選提供了潛在途徑。

根據(jù)本研究結(jié)果，g.11468、g.11478、組合1和組合2的單體型組合分別為C/C、C/C、GGGAAC/GGGAAC和GT/GT時，個體趨向于有較大的管圍率，而這些單體型組合均為純合性。這意味著一旦證實了管圍與免疫能力之間的關(guān)聯(lián)，這些單體型組合可以作為實驗用藏豬的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，本研究測定了89頭人工藏豬種群的部分SLA-DRB基因序列，并從中鑒定出了14個SNP位點，根據(jù)這些SNP位點的連鎖緊密程度識別出3個組合和4個位點。經(jīng)過與體尺指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)組合1的多態(tài)性與藏豬個體的體型存在關(guān)聯(lián)，而g.11468、g.11478、組合1和組合2的位點多態(tài)性則與個體的管圍、管圍率顯著相關(guān)。本研究結(jié)果為SLA-DRB基因作為MAS遺傳標(biāo)記候選基因提供了理論依據(jù)，為藏豬的定向遺傳篩選提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考資料。