謝旭升，李 剛，王曉沁，趙澤宇，李 翼，蘭 平

(1.蘇州大學 a.紡織與服裝工程學院 ; b.現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室， 江蘇 蘇州215123；2.曼切斯特大學 材料學院， 曼切斯特 M13 9PL 英國；3.中山大學 附屬第六醫(yī)院結(jié)直腸外科， 廣東 廣州 510655)

結(jié)直腸癌是人類第三大高發(fā)病率和死亡率的癌癥，且逐年增多，已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注[1-2]。其主要發(fā)病因素包括家族遺傳和不良飲食習慣如高脂肪、低纖維以及吸煙飲酒等，外界環(huán)境因素包括血吸蟲病、盆腔放射等[3-5]。腸梗阻是結(jié)直腸癌的常見癥狀之一，其發(fā)生率高達5%～20%，有時甚至為其首發(fā)癥狀，如果不進行干預(yù)治療，5年內(nèi)患者的死亡率為80%～90%。針對腸癌患者，常用的治療方法是手術(shù)配合放化療治療[6-7]。然而，放化療引起的全身副作用大，危害患者的正常身體健康，而且化療藥物經(jīng)代謝后，腫瘤部位的有效藥物濃度非常低，不能達到有效的治療效果[8-10]。對于腫瘤引起急性腸梗阻者，急診手術(shù)風險大、不能耐受手術(shù)者以及多發(fā)轉(zhuǎn)移和失去手術(shù)機會的晚期患者，放置腸道支架解除梗阻，進行姑息治療后再配合化療等輔助治療手段，是一個有效的治療思路[11]。

支架植入作為一種新興的治療結(jié)直腸癌的有效輔助手段，據(jù)統(tǒng)計其理論與臨床的成功率分別為90%與88%[12-13]。病人在進行結(jié)腸鏡檢查后確定腸梗阻位置后，準確植入腸道支架，其不僅可以支撐擴張腸道、緩解梗阻，恢復(fù)病人排便功能；對于可以切除的腫瘤疾病，支架植入作為前期的輔助治療方法，一定程度緩解病情，為后期的化療或者放療提供機會[14-16]。

近年來，一種從植物中提取的化合物——姜黃素的出色抗癌功能越來越引起研究者的關(guān)注。姜黃素的分子結(jié)構(gòu)(如圖1所示)中的酚醛基側(cè)鏈和中央的亞甲基碳基團都可以脫掉一個氫原子，形成穩(wěn)定的無毒害的自由基，它能選擇性地誘導(dǎo)癌細胞凋亡而對正常細胞作用很小[17-19]。絲素蛋白是一種含有人體必需氨基酸的天然蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性和力學性能，在體內(nèi)降解緩慢，適合用于藥物緩釋載體材料[20-23]。

本文開發(fā)一種新型絲素蛋白復(fù)合腸道支架，內(nèi)層為采用緯編工藝制備的聚二氧六環(huán)酮(PDO)可降解裸支架，外層為采用烘干成膜工藝制備的絲素蛋白搭載姜黃素藥膜，其制備流程如圖2所示。將探討裸支架的力學性能，以及藥膜的微觀形貌、二級結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)和藥物緩釋性能，并分析其中的影響因素。

圖1 姜黃素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Curcumin molecular structure

圖2 覆膜腸道支架的制備過程Fig.2 Preparation of covered intestinal stent

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料及儀器

桑蠶絲(購自嵊州市協(xié)和絲綢有限公司)；PDO單絲(國標規(guī)格3-0)(購自韓國三洋公司)；聚乙二醇(PEG-400，相對分子質(zhì)量為400，優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司)；姜黃素(Sigma)；其他所用試劑均為分析純。

自制ST-06SL型小口徑圓緯織機；日立S 4800型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM): 日本Hitachi公司；Thermo Nicolet 5700 型傅里葉變換紅外光譜儀: 美國尼高力儀器公司；X射線衍射儀: 荷蘭飛利浦公司；Bio-Tek synergy H1型酶標儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)層PDO裸支架的制備

內(nèi)層裸支架采用直徑為0.3 mm 的PDO單絲，選擇小口徑圓緯織機: 針筒直徑為20 mm，針齒數(shù)為22，織物張力為2 N，彎紗深度為3 mm，編織速度為3 m/min。按照上述參數(shù)，編織30 min后得到長度為60 mm、內(nèi)徑為20 mm的裸支架。將所制裸支架嵌套在直徑為20 mm的管狀模型上，進行熱定型處理15 min，熱定型溫度為80 ℃。

1.2.2 外層藥膜的制備

室溫下，經(jīng)過溶絲、透析、離心及濃縮，得到質(zhì)量分數(shù)為5%、10%及15%的絲素蛋白溶液。姜黃素溶解于PEG-400中，再與絲素蛋白溶液均勻混合，通過磁力攪拌和超聲分散，得到均勻穩(wěn)定的混合液。

選擇質(zhì)量分數(shù)為10%的絲素蛋白溶液，質(zhì)量分數(shù)為40%及100%的PEG-400溶液，質(zhì)量濃度為100、50、25、10及5 mg/mL的姜黃素溶液，按上述操作依次混合，結(jié)果如圖3所示，得到姜黃素的最佳質(zhì)量濃度為5 mg/mL。

選擇絲素蛋白溶液的質(zhì)量分數(shù)為5%、10%及15%， PEG-400與絲素蛋白溶液的質(zhì)量配比為1∶3(姜黃素的質(zhì)量分數(shù)為0.125%)、1∶6(姜黃素的質(zhì)量分數(shù)為0.071%)及1∶9(姜黃素的質(zhì)量分數(shù)為0.056%)，溫度為25、60及80 ℃，設(shè)計9組正交試驗，如表1所示，進行成膜試驗。

(a)姜黃素質(zhì)量濃度為100 mg/L,PEG-400質(zhì)量分數(shù)為100%

(b)姜黃素質(zhì)量濃度為100 mg/L,PEG-400質(zhì)量分數(shù)為40%

(c)姜黃素質(zhì)量濃度為50 mg/L,PEG-400質(zhì)量分數(shù)為40%

(d)姜黃素質(zhì)量濃度為25 mg/L,PEG-400質(zhì)量分數(shù)為40%

(e)姜黃素質(zhì)量濃度為10 mg/L,PEG-400質(zhì)量分數(shù)為40%

(f)姜黃素質(zhì)量濃度為5 mg/L,PEG-400質(zhì)量分數(shù)為40%圖3 質(zhì)量分數(shù)為10%的絲素蛋白溶液與不同質(zhì)量濃度的姜黃素溶液和不同質(zhì)量分數(shù)的PEG-400溶液的混合溶液Fig.3 The mixed solution of silk fibroin, curcumin with different concentrations and PEG-400 with mass fraction of 10% different mass fraction表1 外層藥膜的正交試驗參數(shù) Table 1 The orthogonal experimental parameters of outer drug membrane

試驗號ABC絲素蛋白質(zhì)量分數(shù)/%PEG-400與絲素蛋白溶液的質(zhì)量配比溫度/℃1#11151∶3常溫2#12251∶6603#13351∶9804#212101∶3605#223101∶6806#231101∶9常溫7#313151∶3808#321151∶6常溫9#332151∶960

1.2.3 藥膜形貌表征

隨機選取外層藥膜樣品，并對其進行噴金處理90 s，在日立S 4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察藥膜表面形態(tài),放大倍數(shù)為5 000。

1.2.4 二級結(jié)構(gòu)表征

隨機選取純絲素膜和9組藥膜樣品，剪成粉末狀，取2 mg樣品和20 mg的溴化鋰在瑪瑙研缽中研磨，放入模具，壓成薄片，利用Thermo Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀檢測，分析其二級結(jié)構(gòu)。

1.2.5 晶體結(jié)構(gòu)表征

隨機選取PEG-400與絲素蛋白溶液的質(zhì)量配比為1∶3、1∶6及1∶9的藥膜樣品，剪成粉末狀，選用150目篩子篩選樣品，進行下一步測試。利用X射線衍射儀和超能探測針計數(shù)器記錄5°～45°之間的衍射強度曲線。

1.2.6 藥物緩釋表征

將不同載藥量的藥膜進行水蒸氣處理6 h，使其不溶于磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)。精確量取藥膜裝于5 mL離心管內(nèi)，加入2 mL 磷酸鹽緩沖溶液，密封后置于恒溫搖床(37 ℃，100 r/min)。一定時間間隔吸取0.5 mL待測液，同時滴加0.5 mL新鮮磷酸鹽緩沖溶液，測定姜黃素(波長為425 nm)的累積釋放率。

2 結(jié)果及討論

2.1 支架力學性能

支架管壁厚度為0.3～1.5 mm，節(jié)距為5～10 mm，軸向密度為15～20束/cm，單位質(zhì)量為0.03～0.06 g/cm。所獲得支架經(jīng)過熱定型后，其徑向支撐力為30～240 cN，縱向拉伸強度大于20 MPa，橫向拉伸強度大于10 MPa。

2.2 不同參數(shù)對藥膜形貌的影響

外層藥膜借助支架支撐力作用，直接貼合病灶部位，進行緩釋治療作用。因此，藥膜表面平整度及空隙對于治療效果至關(guān)重要[24]。利用PEG-400誘導(dǎo)絲素蛋白成膠，然后風干成膜，得到了不溶于水的絲素蛋白膜，不同參數(shù)的藥膜外觀形貌如圖4所示。從圖4可以看出，7#藥膜透明度高，表面平整光滑，不存在空隙。因此，外層藥膜的最佳成膜工藝參數(shù)為: 絲素蛋白質(zhì)量分數(shù)15%，PEG-400與絲素蛋白溶液的配比1∶3，溫度80 ℃。

(a) 1#

(b) 2#

(c) 3#

(d) 4#

(e) 5#

(f) 6#

(g) 7#

(h) 8#

(i) 9#圖4 不同參數(shù)的藥膜外觀形貌Fig.4 Morphology of drug membrane with different parameters

2.3 紅外光譜分析

文獻[25-26]研究表明，酰胺I(1600～1700 cm-1)中，β-折疊的最大吸收峰在1616～1637 cm-1，無規(guī)卷曲的最大吸收峰出現(xiàn)在1638～1655 cm-1，α-螺旋的最大吸收峰在1656～1662 cm-1，β-轉(zhuǎn)角的最大吸收峰在1663～1696 cm-1。純絲素蛋白膜和不同參數(shù)條件下所制藥膜的傅里葉變換紅外光譜如圖5所示。由圖5可知，純絲素蛋白膜主要以silk Ⅰ的結(jié)構(gòu)存在，而不同參數(shù)藥膜的特征吸收峰發(fā)生了明顯的偏移，說明絲素蛋白在處理后發(fā)生了構(gòu)象上的轉(zhuǎn)變，由silk Ⅰ結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)閟ilk Ⅱ結(jié)構(gòu)。

圖5 純絲素膜及不同參數(shù)藥膜的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of silk membrane and drug membrane with different parameters

圖6 配比為1∶3、1∶6及1∶9藥膜的X射線衍射光譜圖(絲素蛋白質(zhì)量分數(shù)為15%，溫度為80 ℃)Fig.6 X-ray diffraction pattern of drug membrane with different ratio of 1∶3，1∶6 and 1∶9 (silk fibroin mass fraction was 15%, temperature was 80 ℃)

2.4 X射線衍射分析

純絲素蛋白膜主要以silk I的結(jié)構(gòu)存在，為了探究姜黃素的質(zhì)量分數(shù)對絲素蛋白結(jié)構(gòu)的影響，選取絲素蛋白質(zhì)量分數(shù)為15%，溫度為80 ℃， PEG-400與絲素蛋白溶液的質(zhì)量配比分別為1∶3、1∶6及1∶9[27]，觀察不同配比情況下，藥膜中絲素蛋白結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。不同配比藥膜的X射線衍射光譜結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，藥膜中絲素蛋白結(jié)構(gòu)均轉(zhuǎn)變成silk II，在20.16°處出現(xiàn)了衍射峰，這種現(xiàn)象與FT-IR譜圖顯示的結(jié)果一致。

2.5 藥物緩釋分析

選取絲素蛋白質(zhì)量分數(shù)為15%，溫度為80 ℃， PEG-400與絲素蛋白的質(zhì)量配比分別為1∶3、1∶6及1∶9不同參數(shù)的藥膜中姜黃素的釋放曲線如圖7所示。由圖7可知，載藥量越高，藥物釋放速率越大，累積釋放率越高。載藥量不同的藥膜約在200 h內(nèi)持續(xù)釋放，400 h 達到藥物最高釋放濃度，其中，藥物最高累積釋放質(zhì)量濃度為(13.32±0.80)mg/L,最高累積釋放率為(98.67±5.93)%。由此說明所制藥膜具備很好的藥物緩釋性能。

圖7 不同載藥量藥膜的藥物緩釋曲線Fig.7 In vitro drug release profile of drug membrane with different composition

3 結(jié) 語

本文制備了一種新型絲素蛋白復(fù)合腸道支架，并探討了內(nèi)層支架力學性能，外層藥膜的形貌結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)及藥物緩釋性能。研究結(jié)果表明: 當絲素蛋白質(zhì)量分數(shù)為15%、PEG-400與絲素蛋白溶液的質(zhì)量配比為1∶3(姜黃素的質(zhì)量分數(shù)為0.125%)、溫度為80 ℃時，可以制備出最佳藥膜；相較于純絲素蛋白膜，藥膜中的絲素蛋白的構(gòu)象由silk Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)閟ilk Ⅱ。絲素蛋白搭載姜黃素納米纖維可以實現(xiàn)藥物的穩(wěn)控釋放，具備優(yōu)良的藥物緩釋性能。因此，絲素蛋白基藥物緩釋功能腸道支架在治療結(jié)直腸患者過程中具備一定的潛在價值。