高雁鴻, 王 耀,張年萍

（1.大同市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西大同037009;2.山西大同大學(xué)第一臨床醫(yī)院，山西大同037009；3.大同市第五人民醫(yī)院輸血科山西大同037009；4.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同037009）

隨著生活水平的提高，飲食種類和方式變得越加豐富，但也隨之而來產(chǎn)生諸多健康問題，比如慢性疾病的發(fā)生率逐年增高。全世界不少人正飽受慢性疾病的困擾，糖尿病是僅次于繼癌癥和心血管疾病的高發(fā)病率疾病[1]，是全球關(guān)注的公共健康問題。腸道菌群是人體腸道微生物種類總稱，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、吸收和代謝等生理作用。研究發(fā)現(xiàn)[2]，糖尿病的發(fā)病和發(fā)展與腸道菌群存在很大聯(lián)系，調(diào)節(jié)2型糖尿病患者腸道菌群結(jié)構(gòu)可改善胰島素抵抗、糖代謝紊亂和氧化應(yīng)激等病理性改變。雙歧桿菌(bifidobacterium)是一類腸道主要有益菌群[3]。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌屬總量顯著減少[4]，但其中機(jī)制尚不清楚。本研究采用2型糖尿病小鼠造模與雙歧桿菌干預(yù)同時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)方法，檢測雙歧桿菌干預(yù)2型糖尿病小鼠后對(duì)腸道菌群及對(duì)腎功能的影響，為治療糖尿病的輔助療法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

體質(zhì)量15～20 g的3～4周齡C57BL/6J健康雌性小鼠，數(shù)量為30只，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠分為正常對(duì)照組、模型組和雙歧桿菌干預(yù)組，每組10只。正常組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料；模型組給予高脂高糖飼料，6周后腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）1%(20 mg/kg)腹腔注射；雙歧桿菌干預(yù)組給予高脂高糖飼料+雙歧桿菌，6周后STZ腹腔注射，劑量和濃度與模型組一致，同時(shí)給予雙歧桿菌灌胃，連續(xù)喂養(yǎng)8周。

1.2 儀器試劑

厭氧液體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)公司）培養(yǎng)雙歧桿菌，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后菌落計(jì)數(shù)，以2×109CFU的菌液進(jìn)行灌胃。DNA Marker、5×Loading buffer來源于北京擎科生物生物技術(shù)公司，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、2×PCR MASTER MIX來源于賽默飛生物科技公司，鏈脲佐菌素(STZ)來源于Sigma公司，糞便DNA提取試劑盒來源于Sigma公司，DNA純化試劑來源于QIAGEN生物工程有限公司。全自動(dòng)生化分析儀，邁瑞B(yǎng)S-220，三諾血糖儀、代謝籠等。肌酐、尿素氮檢測劑盒，均來源于寧波美康生物科技有限公司。

1.3 標(biāo)本采集及處理

最后一次灌胃后禁食14 h，血糖儀檢測空腹血糖，收集24 h尿液并記錄尿量，無菌收集各組小鼠糞便，-80℃保存，股動(dòng)脈取血，收集3 mL血液，3000 r/min離心10 min，獲得血清，-20℃保存。

1.4 小鼠腎功能測定

全自動(dòng)生化分析儀檢測尿微量白蛋白(Alb)、尿肌酐(Cr)、計(jì)算尿Alb/尿Cr(ACR)、24 h尿蛋白定量，試劑盒檢測血清肌酐（SCr）、血清尿素氮(BUN)。

1.5 T-RFLP技術(shù)分析腸道菌群

1.5.1 糞便DNA的提取

根據(jù)糞便DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.5.2 PCR擴(kuò)增

16S rRNA基因通用引物:F:5'TGCCAGCAGCCGCGGTA-3'(5'-FAM標(biāo)記);R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，50 μl體系:0.5μl EXTaq酶，25μl 2×PCR MASTER MIX，F(xiàn),R（10μlmol/L）各0.5μl，0.5μl 8-Methoxypsoralen（8-MOP）（2.5mg/mL），2 μL模板，加去離子水至50 μL，PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min,95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸1 min，40個(gè)cycle，72℃終延伸10 min。

1.5.3 限制性內(nèi)切酶酶切

37℃水浴4 h，70℃水浴30 min，酶切反應(yīng)體系見表1，酶切產(chǎn)物用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化回收。

表1 酶切反應(yīng)體系

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙歧桿菌干預(yù)對(duì) 2型糖尿病小鼠血糖的影響

模型組小鼠空腹血糖為20.2 mmol/L，明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，提示造模成功。與模型組相比，雙歧桿菌干預(yù)組空腹血糖為8.2 mmol/L，明顯降低(P＜0.01)，但仍高于正常對(duì)照組，提示雙歧桿菌干預(yù)改善糖代謝，但不可完全恢復(fù)至正常水平。

2.2 雙歧桿菌干預(yù)對(duì) 2型糖尿病小鼠腎功能的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組Scr、BUN、24 h尿蛋白水平、ACR升高(P＜0.05)。與模型組比較，雙歧桿菌干預(yù)組小鼠Scr、BUN、24 h尿蛋白水平、ACR均明顯降低(P＜0.05)，結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠Scr、BUN、24 h尿蛋白、ACR水平

2.3 雙歧桿菌干預(yù)對(duì)2型糖尿病小鼠腸道菌群的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組、雙歧桿菌干預(yù)組腸道微生物豐度顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但雙歧桿菌干預(yù)組與模型組無顯著差異（P＞0.05）。提示2型糖尿病小鼠腸道菌種數(shù)量顯著下降，但即使雙歧桿菌干預(yù)這種情況仍不能改善。在腸道菌群多樣性指數(shù)上，模型組和對(duì)照組無顯著差異，但雙歧桿菌干預(yù)組其多樣性指數(shù)均顯著低于模型組和空白組(P＜0.05)，提示雙歧桿菌干預(yù)后，影響了小鼠腸道其它菌群的數(shù)量或活性，降低生物多樣性。但各組小鼠之間的物種均度沒有明顯差異，表明各組小鼠腸道菌群主要菌種含量并無顯著差異，結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠腸道菌群多樣性分析

與正常對(duì)照組相比，模型組雙歧桿菌明顯下降，差異具有顯著性(P＜0.05)，雙歧桿菌干預(yù)組含量顯著高于模型組(P＜0.05)，但與正常對(duì)照組無明顯差異(P＞0.05)。腸道3種主要菌含量均無顯著差異(P＞0.05)。

表4 各組小鼠4種主要腸道細(xì)菌相對(duì)含量

3 討論

2型糖尿病是全球關(guān)注的人類內(nèi)分泌代謝性疾病，誘導(dǎo)因素包括基因調(diào)控及環(huán)境變化。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群具有調(diào)節(jié)機(jī)體營養(yǎng)吸收及代謝、免疫作用及內(nèi)分泌等生理功能，與2型糖尿病等代謝性疾病關(guān)系密切[5]。雙歧桿菌是人體腸道內(nèi)的主要益生菌，其活性和數(shù)量變化與機(jī)體生理病理密切相關(guān)[6-7]。雙歧桿菌可調(diào)節(jié)平衡腸道正常菌群，抑制病原微生物的生長，臨床上常用于治療便秘和胃腸疾病等。研究顯示，2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌屬顯著減少[8]，但其機(jī)制尚未研究清楚。

本研究采用雙歧桿菌干預(yù)2型糖尿病小鼠模型，按照小鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L的診斷標(biāo)準(zhǔn)，提示模型組和雙歧桿菌干預(yù)組造模成功。雙歧桿菌干預(yù)組其空腹血糖明顯下降(P＜0.05)，提示雙歧桿菌具有明顯降低血糖的療效。以往研究顯示，雙歧桿菌具有降低血糖，改善糖代謝的調(diào)節(jié)作用，本研究結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-10]。其機(jī)制可能是糖尿病小鼠腸腔黏附的革蘭陰性桿菌顯著增加，并被腸腔黏膜樹突細(xì)胞吞噬，遷移至代謝活躍的脂肪組織及血液中，以活菌形式導(dǎo)致發(fā)生炎癥。同部位小腸中雙歧桿菌數(shù)目明顯減少。雙歧桿菌可改糖代謝，增加胰島素敏感性，提示雙歧桿菌可阻止病原微生物的遷移和黏附，進(jìn)而有效地改善胰島素抵抗和治療2型糖尿病。各組大鼠腎功能指標(biāo)檢查發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組Scr、BUN、24 h尿蛋白水平、ACR明顯升高。上述指標(biāo)都是臨床檢驗(yàn)中反映腎功能狀態(tài)的有效生化指標(biāo)，此結(jié)果表明誘導(dǎo)糖尿病模型時(shí)同時(shí)造成了腎功能受損。而雙歧桿菌干預(yù)后Scr、BUN、24 h尿蛋白水平、ACR明顯下降(P＜0.05)，但仍高于正常組。此結(jié)果表明，雙歧桿菌干預(yù)后可以逆轉(zhuǎn)受損腎臟功能，但這種功能修復(fù)并不完全可逆，但其機(jī)制上不明確。本研究結(jié)果表明2型糖尿病小鼠腸道菌群物種豐度顯著下降，但增加雙歧桿菌含量小鼠腸道菌群物種豐度與模型組比較并無明顯差異。同時(shí)，2型糖尿病小鼠物種多樣性與正常對(duì)照組小鼠比較沒有顯明顯差異，但雙歧桿菌含量增加后，小鼠腸道微生物物種多樣性明顯下降。這可能是因?yàn)殡p歧桿菌本身就占大部分，含量持續(xù)增加，導(dǎo)致其它物種的數(shù)量和活性減少，進(jìn)而打破了多樣性。

本研究結(jié)果表明，雙歧桿菌可改善2型糖尿病小鼠糖代謝，增加腸道雙歧桿菌的含量，逆轉(zhuǎn)受損腎功能，但其能否成為輔助治療糖尿病前期人群或高危人群的臨床用藥仍需進(jìn)一步研究。