陳云茹，孫陽陽，邸 瑩，唐甜甜，楊雪亮，張 曦，劉小靜，葉 峰，藺淑梅

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，陜西西安 710061；2. 中國解放軍第一醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州 730000；3. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061；4. 西安市兒童醫(yī)院感染科，陜西西安 710003)

纖維介素2(fibrinogen-like protein 2, Fgl2)，也稱為Fgl2凝血酶原酶，屬于纖維蛋白原相關(guān)蛋白超家族，是一種多功能蛋白，有兩種類型：跨膜型Fgl2和可溶性Fgl2(soluble Fgl2, sFgl2)?？缒ば虵gl2作為一種新的凝血因子，其表達異常能夠引起凝血功能紊亂，激活凝血過程，導(dǎo)致纖維蛋白沉積[1]。sFgl2主要是由T淋巴細胞分泌，作為一種免疫抑制因子，它具有抑制T淋巴細胞和樹突狀細胞的功能，介導(dǎo)B淋巴細胞的凋亡[2]。國內(nèi)外已有研究表明，F(xiàn)gl2與同種及異種移植排斥反應(yīng)、自發(fā)性流產(chǎn)、病毒性肝炎、嚴重急性呼吸道綜合癥及腫瘤等疾病有關(guān)[3-7]。近年來，F(xiàn)gl2在病毒性肝炎發(fā)病機制中的作用越來越受到重視。我國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gl2的表達與乙型肝炎患者病情的嚴重程度密切相關(guān)，減少和阻斷其表達有可能成為重型肝炎新的治療途徑和方法[8-9]，但研究主要以病理組織為基礎(chǔ)。多倫多大學(xué)學(xué)者[10]研究了丙型肝炎患者外周血中sFgl2的表達，結(jié)果提示Fgl2可能參與HCV感染后的疾病進展，但未對其臨床價值進行深入探討。為進一步了解sFgl2與慢性病毒性肝炎患者肝臟功能及肝硬化的關(guān)系，探討其對預(yù)測患者臨床轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的價值，本研究檢測了慢性肝炎患者外周血中sFgl2水平，并與臨床相關(guān)指標進行對比分析。

1 材料與方法

1.1研究對象收集2009年9月至2014年3月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科門診和住院部首次診斷為慢性乙型肝炎患者42例，乙型肝炎肝硬化患者35例，慢性丙型肝炎患者43例，丙型肝炎肝硬化患者73例。我院體檢中心72例健康體檢者為健康對照組。

患者共193例，男性136例，女性57例，平均年齡(45.79±13.82)歲。健康對照組72例，其中男性46例，女性26例，平均年齡(47.9±11.80)歲?；颊呓M及健康對照組在年齡及性別間無差異。所有病例診斷均符合2015年中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會及肝病學(xué)分會制定的《中國慢乙肝防治指南》及《中國丙肝防治指南》，即HBsAg及HBV DNA陽性或HCV抗體及HCV RNA陽性半年以上，并結(jié)合癥狀、體征及實驗室影像學(xué)檢查。入選的患者均未接受抗病毒治療。排除甲、丁、戊型病毒性肝炎、乙肝及丙肝重疊感染、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、肝癌、自身免疫性肝炎及其他自身免疫性疾病以及存在嚴重心臟、腎臟疾病的患者。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并取得受試對象的知情同意。

1.2標本的采集與處理收集193例患者及72例健康體檢者的空腹靜脈血5 mL，在抽血后30 min內(nèi)置于離心機3 000 r/min，離心10 min，分離出血清，分裝至1.5 mL離心管中，放置于-80 ℃冰箱保存。

1.3研究方法應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，按照試劑盒[人纖維介素蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒(ELISA)美國R&D公司]說明書檢測患者外周血sFgl2水平；應(yīng)用全自動生物化學(xué)分析儀檢測患者外周血ALT、AST、TBIL、ALB等。應(yīng)用定量聚合酶反應(yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)方法檢測患者血清HBV DNA及HCV RNA載量。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用中位數(shù)表示，對各組年齡、性別比較分別采用方差分析和卡方檢驗。不同組患者及健康對照組外周血sFgl2水平比較采用秩和檢驗，外周血sFgl2水平與病毒載量的相關(guān)性分析應(yīng)用秩和檢驗。血清sFgl2水平與ALT、AST、ALB及TBIL等進行Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同組別血清sFgl2水平如圖1所示，健康對照組、慢性乙型肝炎組、慢性丙型肝炎組、乙型肝炎肝硬化組、丙型肝炎肝硬化組sFgl2水平分別為9.75、32.14、10.89、67.60、35.27 ng/mL；乙肝肝硬化患者sFgl2水平高于慢性乙肝患者(P<0.001)，丙肝肝硬化患者sFgl2 水平高于慢性丙肝患者(P=0.023)；乙型肝炎肝硬化患者sFgl2水平高于丙型肝炎肝硬化患者(P=0.024)，且各組患者sFgl2水平均高于健康對照組。

圖1不同組別血清sFgl2水平

Fig.1 The level of serum sFgl 2 in different groups

2.2不同程度肝硬化患者外周血sFgl2水平不考慮病原學(xué)，根據(jù)肝硬化的Child-Pugh分級標準將肝硬化患者進行分級，其中，Child A級48例，Child B級34例，Child C級26例，由圖2可知，Child評分越高，血清sFgl2水平越高，3組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.011)。Child C級患者sFgl2 水平明顯高于Child A級(P=0.004)和Child B級(P=0.042)；Child B級患者sFgl2水平高于Child A級，但兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.188)。

圖2各組sFgl2水平與Child-Pugh分級的關(guān)系

Fig.2 Correlation between sFgl 2 and Child -Pugh grades

2.3血清sFgl2水平與乙型肝炎患者病毒復(fù)制水平的相關(guān)性分析對慢性HBV感染者進行HBV DNA載量檢測，將HBV DNA水平分為≤103IU/mL、103107IU/mL 4組，用秩和檢驗分析sFgl2在HBV DNA 4組間的分布情況，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.247，圖3)。

2.4血清sFgl2水平與丙型肝炎患者病毒復(fù)制水平的相關(guān)性分析將慢性HCV感染者根據(jù)HCV RNA載量分為≤103IU/mL、103106IU/mL 5組，用秩和檢驗分析sFgl2在HCV RNA 5組間的分布情況，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.713，圖4)。

圖3不同HBVDNA載量組血清sFgl2水平

Fig.3 The level of serum sFgl 2 in different groups of HBV DNA load

圖4不同HCVRNA載量組血清sFgl2水平

Fig.4 The level of serum sFgl 2 in different groups of HCV RNA load

2.5血清sFgl2水平與患者ALT、AST、TBIL、ALB的相關(guān)性分析血清sFgl2與ALT、AST、TBIL和ALB分別進行相關(guān)性分析，sFgl2與ALT及AST均無相關(guān)性(r=-0.044，P=0.652；r=0.065，P=0.507，圖5A、5B)，sFgl2與TBIL正相關(guān)(r=0.226，P=0.019，圖5C)，sFgl2與ALB負相關(guān)(r=-0.209，P=0.03，圖5D)。

圖5血清sFgl2水平與患者肝功指標的相關(guān)性分析

Fig.5 Correlation between of serum sFgl 2 and liver function indexes in the patients

3 討 論

Fgl2是近年來發(fā)現(xiàn)的一種多功能蛋白，含有439個氨基酸，分為跨膜型及可溶性兩種[1]?？扇苄岳w維介素2是一種新發(fā)現(xiàn)的由調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell, Treg)分泌的重要的效應(yīng)分子，其生物學(xué)功能已成為近年來研究的熱點[11]。有研究表明，F(xiàn)gl2可導(dǎo)致敏感型小鼠爆發(fā)性病毒性肝炎[3]，CHAN等[12]報道了小鼠的sFgl2能抑制T淋巴細胞的增殖，提示sFgl2在免疫耐受方面發(fā)揮了重要的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，sFgl2可通過與B細胞表達的FcγRⅡB連接而誘導(dǎo)B細胞凋亡[13]。重組的sFgl2還可以通過增加IL-4和IL-10水平促進T細胞形成Th2細胞，抑制IL-2、IFN-γ 等Th1細胞因子分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]。綜上推測，Treg細胞分泌的sFgl2可能抑制了機體針對于肝炎病毒的T淋巴細胞反應(yīng)，從而促進了病毒的復(fù)制和肝病的進一步發(fā)展。因此，sFgl2在病毒性肝炎發(fā)生發(fā)展中的作用值得深入探討。

本研究比較了不同人群外周血sFgl2水平，發(fā)現(xiàn)血清sFgl2水平在肝硬化組顯著高于非肝硬化組及健康對照組。乙型和丙型肝炎病毒慢性化感染及慢性化感染導(dǎo)致的肝硬化的機制十分復(fù)雜，大量研究表明，Th1/Th2細胞失衡及免疫耐受狀態(tài)對HBV及HCV感染導(dǎo)致的慢性化起到了重要作用[15-16]，本結(jié)果提示，升高的sFgl2可能是導(dǎo)致免疫耐受狀態(tài)的重要環(huán)節(jié)。因此，針對sFgl2的治療可能成為慢性病毒性肝炎潛在的免疫治療靶點。

Child-Pugh分級是目前臨床常用的評估肝硬化嚴重程度的量化指標，該評分雖簡便易行，但其中有兩項(肝性腦病、腹水)是主觀指標，根據(jù)醫(yī)生臨床經(jīng)驗的不同可能產(chǎn)生誤差，且藥物的使用(如使用利尿劑或乳果糖、輸白蛋白)可能會影響上述兩種指標的評估，需要進一步探索能夠更準確預(yù)測肝硬化患者預(yù)后的客觀指標[17]。本研究結(jié)果顯示，不管肝硬化的病因?qū)W為HBV或HCV，隨Child-Pugh評分升高，外周血sFgl2水平有逐漸升高的趨勢，Child C級患者sFgl2水平明顯高于Child A級和Child B級，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示sFgl2與肝硬化的嚴重程度相關(guān)，可能成為預(yù)測肝硬化預(yù)后的重要指標。

此外，本研究還比較了外周血sFgl2與乙肝及丙肝患者病毒載量的相關(guān)性，研究結(jié)果顯示，無論是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒，sFgl2均與病毒載量無相關(guān)性，而加拿大的NAZIA SELZNER等[10]對80例HCV RNA陽性的患者檢測了外周血的sFgl2，發(fā)現(xiàn)sFgl2與HCV RNA水平呈正相關(guān)，兩個研究結(jié)果的不一致可能與研究的納入標準不同有關(guān)，需大樣本研究及體外實驗進一步驗證。

同時，我們還分析了sFgl2水平與肝功能的相關(guān)性，結(jié)果顯示，無論是乙型肝炎或丙型肝炎患者，其 sFgl2水平與TBIL呈正相關(guān)，與ALB呈負相關(guān)，提示sFgl2可能參與了肝細胞的炎癥壞死，從而影響了肝細胞的合成功能。

有趣的是，本研究還發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎肝硬化患者sFgl2水平明顯高于丙型肝炎肝硬化患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，已有研究表明，HBV C蛋白和X蛋白及丙型肝炎病毒的核心蛋白均具有激活人Fgl2基因的功能[18-19]，需進一步探討兩種病毒對Fgl2基因的激活功能的差異及相關(guān)機制。

本研究具有以下局限性。由于重點在于分析sFgl2與慢性病毒性肝炎肝損害臨床指標的相關(guān)性，故未涉及機制研究；本研究為病例對照研究，其結(jié)論需隊列研究進一步論證。

總之，作為一種多功能蛋白，sFgl2參與肝硬化、肝癌及重型肝炎的病理生理過程，具體機制涉及凝血及免疫功能的調(diào)節(jié)。本課題組進一步證實了外周血sFgl2在肝硬化患者中明顯升高，同時發(fā)現(xiàn)sFgl2水平與肝硬化患者Child分級有相關(guān)性，可能作為肝硬化患者的預(yù)后因素之一，需要建立長期隨訪隊列，進一步評估外周血sFgl2水平與肝硬化、肝癌進展及預(yù)后的相關(guān)性，為肝硬化患者預(yù)后的評估提供有效工具。