焦自釗，薛武軍，安茂竹，付海霞，李 楊，李鳳樓，盛練芬

(1.濟寧醫(yī)學院附屬日照市人民醫(yī)院血液凈化科，山東日照 276800；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院腎臟病醫(yī)院腎移植科，陜西西安 710061)

目前組織工程學在人工皮膚、血管、骨、心臟瓣膜等組織再建方面已取得了長足的進展，但是人工組織的血管化障礙問題依然是限制組織工程產品臨床應用的主要因素之一[1-3]。加速組織血管化，為組織提供足夠的營養(yǎng)物質，是構建有效的組織工程產品亟待解決的主要問題。小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)是一種天然細胞外基質材料，在組織工程學實驗研究中作為支架材料已得到成功應用[4-6]。研究發(fā)現，SIS除主要成分Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維外，還含有血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, b-FGF)等促進血管內皮細胞增生及血管生成的細胞因子[7-9]。因此，本研究擬分離、培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞(umbilical vein endothelial cells, UVECs)，并與制備的SIS體外共培養(yǎng)，研究SIS對UVECs體外增殖及成血管化功能的影響，為利用SIS制備血管化組織工程產品奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料豬空腸段小腸來自經過檢疫的健康成年豬(西安市肉聯加工廠提供)；臍帶組織來自健康孕婦足月妊娠經剖腹產娩出的新生兒臍帶組織(西安交通大學第一附屬醫(yī)院產科提供)，取標本前經醫(yī)院倫理委員會及患者知情同意。

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(VEGF、b-FGF)及異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗人的CD31抗體、藻紅蛋白(PE)標記的兔抗人vWF抗體(美國 Sigma 公司)；膠原酶Ⅱ及胰酶(德國Roche公司)；胎牛血清(FBS)及RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibico公司)；兔抗豬Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白抗體及錐蟲藍(北京中杉公司)；倒置式顯微鏡及VANOX型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；5100型細胞培養(yǎng)箱(美國NAPCC公司)。

1.2UVECs的分離、培養(yǎng)及鑒定按文獻[10]方法，用PBS液沖洗臍靜脈血液后灌注1 g/L的膠原酶Ⅱ使其充盈，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育15 min，收集消化液，并用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗管腔，將消化液與沖洗液一并收集，1 000 r/min，離心5 min；RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含200 mL/L胎牛血清、20 ng/L hVEGF121、L-谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)重懸沉淀，調整細胞密度并以5×104/cm2接種于預先用10 g/L明膠溶液鋪被的細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、飽和濕度、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。應用FITC標記的兔抗人CD31抗體、PE標記的兔抗人vWF抗體對UVECs進行免疫熒光鑒定。

1.3SIS的制備及鑒定按文獻[11]方法稍加改良制備SIS，每次制備取健康成年豬新鮮空腸5 cm，清水沖洗干凈后浸泡于冰無菌生理鹽水中。切開小腸，冰無菌生理鹽水沖洗，清除小腸內外壁粘附物。沿管腔縱向刮除黏膜層、漿膜及肌層，得到約100 μm厚的半透明狀SIS基質。依次按以下步驟進行去細胞處理：將基質在含100 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和10 mmol/L氫氧化鈉(NaOH)的溶液中浸泡8 h(pH 11～12)，1 mol/L鹽酸(HCl)和1 mol/L氯化鈉(NaCl)溶液中浸泡8 h，再于含1 mol/L NaCl的磷酸緩沖鹽(PBS)溶液中(pH 7～7.4)浸泡16 h，PBS溶液浸泡2 h，每次更換浸液前用去離子水將基質沖洗干凈。25 kGy γ-射線照射消毒滅菌。

組織學鑒定：觀察制備的SIS大體外觀后，將SIS基質于4 g/L的多聚甲醛中固定24 h，制作4 μm厚石蠟切片，HE染色后觀察SIS纖維結構，應用兔抗豬Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白抗體對SIS進行免疫組化染色。

1.4ELISA檢測SIS的細胞因子水平將SIS剪切成邊長2.5 cm正方形，置于6孔板板孔，每孔加入PBS液2 mL，4 ℃震動孵育24 h。設單獨PBS液為對照組，每組設6個平行孔。按兔抗豬VEGF及b-FGF的ELISA試劑盒方法測定上清液VEGF及b-FGF濃度。

1.5SIS和UVECs共培養(yǎng)設UVECs和SIS共培養(yǎng)組及UVECs單獨培養(yǎng)組。每組取8個6孔板，設48個平行孔，均用10 g/L明膠溶液鋪板。共培養(yǎng)組：剪切成邊長2.5 cm正方形SIS，粗面向上鋪平，按密度1×104個/孔種入UVECs，37 ℃、飽和濕度、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。UVECs單獨培養(yǎng)組：每孔種植1×104個UVECs，不鋪SIS。

倒置顯微鏡下觀察UVECs的生長特性及成血管化情況。每天每組取6孔培養(yǎng)的UVECs，2.5 g/L的胰酶消化，錐蟲藍染色計數，每孔計數3次，取平均數，共計數8 d。繪制各組UVECs細胞生長曲線，計算細胞群體倍增時間。

2 結 果

2.1血管內皮細胞的形態(tài)與鑒定結果倒置顯微鏡下觀察(圖1)，UVECs貼壁單層生長，鋪路石樣鑲嵌排列，細胞為扁平多角形，邊界清楚；胞核清晰可見，為圓形或橢圓形。UVECs的CD31、vWF血管內皮細胞相關抗原免疫熒光檢測呈陽性反應，結合其形態(tài)學特征，證實培養(yǎng)的細胞為血管內皮細胞。

圖1UVECs的形態(tài)及免疫熒光鑒定

Fig.1 Morphological and immunofluorescence identification of UVECs (×100)

A：倒置顯微鏡下觀察結果；B：FITC-CD31免疫熒光抗體染色陽性；C：PE-vWF免疫熒光抗體染色陽性。

2.2SIS的組織學觀察及鑒定情況分離獲得的SIS為乳白色半透明狀，無破損，無平滑肌細胞及血管殘留，平鋪后可見明顯的脈絡狀膠原。HE染色見SIS膠原纖維結構平整呈網織狀均勻排列，無斷裂，無細胞成分；免疫組化染色見SIS的兔抗豬Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白染色均呈陽性反應(圖2)，符合SIS組織學特點。

2.3SIS的細胞因子檢測結果ELISA檢測SIS組上清液各因子水平分別為VEGF(48.83±5.67)ng/mL，b-FGF(72.36±8.71)ng/mL；PBS液對照組未檢測到VEGF及b-FGF。表明SIS含有一定量的VEGF、b-FGF等促進血管內皮細胞增生及成血管化的生長因子。

圖2SIS的組織學觀察及鑒定結果

Fig.2 Histological examination of SIS (A、B,×200; C,×100)

A：SIS的HE染色；B：SIS的兔抗豬Ⅰ型膠原蛋白染色呈陽性反應；C：SIS的兔抗豬Ⅲ型膠原蛋白染色呈陽性反應。

2.4SIS的促進血管內皮細胞增生及成血管化作用培養(yǎng)24 h時，倒置顯微鏡下可見，UVECs單獨培養(yǎng)組UVECs形態(tài)未發(fā)生變化，細胞密度相對稀疏；UVECs和SIS共培養(yǎng)組UVECs細胞生長相對致密，細胞突起相互連接形成血管樣結構，說明UVECs在SIS上具有血管形成功能(圖3A、圖3B)。培養(yǎng)8 d的UVECs生長曲線可見UVECs和SIS共培養(yǎng)組曲線上移，UVECs在第2天進入對數生長期，持續(xù)時間為3 d；UVECs單獨培養(yǎng)組則在第3天UVECs進入對數生長期，持續(xù)時間為2 d。培養(yǎng)第4、5天時，UVECs和SIS共培養(yǎng)組UVECs計數分別為(7.91±0.42)×104、(9.15±0.48)×104，均大于UVECs單獨培養(yǎng)組的(4.26±0.27)×104、(6.71±0.31)×104(P<0.01)。根據公式DT=T×Lg2/(LgNt―LgNo)(DT：倍增時間；T：培養(yǎng)時間；Nt：對數生長期終點計數；No：首次細胞計數)，計算UVECs群體倍增時間，UVECs和SIS共培養(yǎng)組為(1.28±0.21)d，明顯短于UVECs單獨培養(yǎng)組的(2.14±0.37)d(P<0.01，圖3C)。

圖3UVECs的血管化及生長曲線

Fig.3 Vascularization and growth curve of UVECs (A、B, ×200)

A：UVECs單獨培養(yǎng)組；B：UVECs+ SIS共培養(yǎng)組；C：UVECs的生長曲線，與UVECs單獨培養(yǎng)組比較，*P<0.01。

3 討 論

近年來，盡管組織工程領域的研究取得了飛速發(fā)展，但能夠用于臨床的組織工程產品數量非常有限，主要原因之一就是組織工程的血管化問題難以解決，以致組織工程產品的種子細胞因不能及時得到血液供應而發(fā)生缺血缺氧性壞死[1-3]。加速組織工程產品的血管化，為組織工程產品種子細胞提供足夠的營養(yǎng)物質，從而構建有效的血管化組織工程產品已引起了廣泛的關注。

組織工程學所需要的主要材料包括種子細胞、天然或非天然的生物支架材料及促進細胞增生、分化的生物活性因子[12-14]。SIS是一種不含細胞的天然細胞外基質材料，主要由Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維構成，具有良好的組織相容性，已作為生物支架材料廣泛用于組織缺損修復的研究(血管、骨、皮膚、硬腦膜、膀胱等)，并取得了良好的效果[15-17]。研究發(fā)現，細胞外基質是細胞微環(huán)境的主要成分，不僅為各種細胞提供骨架結構與附著位點，而且在細胞的黏附、遷移、增殖、分化、組織特異性維持、凋亡誘發(fā)相關基因表達抑制等方面發(fā)揮著重要作用，如細胞外基質與細胞表面整合素的結合可以激活細胞內Ras-Raf-MEK-ERK等細胞增殖信號轉導通路，從而避免細胞進入凋亡的級聯步驟以致細胞失巢凋亡(anoikis)[18-19]。SIS生物支架材料除膠原蛋白外還含有豐富的蛋白多糖和纖維粘連蛋白，與細胞外基質組成和結構類似，能夠為細胞植入重建合適的微環(huán)境，從而促進細胞與組織間的粘附及細胞的增殖和分化[20]。在組織血管化方面，研究發(fā)現SIS不但包含多種促進血管內皮細胞增殖及成血管化的生長因子，如VEGF及b-FGF等，而且VEGF及b-FGF等生長因子在組織工程中還呈獨特的三維分布，如VEGF主要分布在血管周圍，b-FGF與纖維結構相連，呈彌散分布[7-9]?；赟IS的細胞外基質特點，我們考慮SIS和血管內皮細胞共培養(yǎng)可以為血管內皮細胞提供骨架結構與附著位點，有利于血管內皮細胞在SIS上黏附、遷移、增殖；并且SIS所含的促進血管內皮細胞增殖和成血管化的生長因子及其獨特的三維分布，更有利于血管內皮細胞增殖及血管內皮細胞形成管狀的血管樣結構。

本研究通過免疫組化及ELISA檢測制備的SIS，發(fā)現制備的SIS含有Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及促血管內皮細胞生長因子(VEGF、b-FGF)等組分且不含細胞，證實了制備的SIS具有細胞外基質特性，且含有多種促進血管內皮細胞增殖及成血管化的生長因子。應用SIS與UVECs體外共培養(yǎng)發(fā)現，UVECs和SIS共培養(yǎng)組UVECs密度較UVECs單獨培養(yǎng)組相對致密，且有血管樣結構形成；UVECs生長曲線顯示，對數生長期的UVECs細胞數在UVECs和SIS共培養(yǎng)組大于UVECs單獨培養(yǎng)組；計算UVECs群體倍增時間，UVECs和SIS共培養(yǎng)組短于UVECs單獨培養(yǎng)組。以上結果說明，SIS的細胞外基質特性及其所含促血管內皮細胞生長因子等組分能夠促進血管內皮細胞的增殖及成血管化。這提示應用SIS作為生物支架材料進行組織工程構建能夠促進組織工程產品的血管化，也為利用SIS制備血管化組織工程產品并進行體內移植奠定了實驗基礎。