孫海鳳，趙興宇，經(jīng) 里，郭亞煥，雷寶霞，陳文娟，趙 征，南克俊，楊廣寧

(1. 陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)系，陜西西安 710061；3. 兵器工業(yè)521醫(yī)院耳鼻咽喉科，陜西西安 710061；4. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西西安 710061；5. 陜西省腫瘤醫(yī)院微創(chuàng)介入科，陜西西安 710061)

最新流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)資料顯示，中國(guó)原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的新發(fā)病例466 100例，居惡性腫瘤的第4位，死亡病例422 100例，居第3位，而美國(guó)新發(fā)病例40 710例，死亡病例28 920例[1-2]。由于肝癌發(fā)展迅速，缺乏有效的治療手段，5年生存率不足5%，預(yù)后極差。雖然分子靶向藥物已成為治療肝癌的重要手段，但其有效率仍然較低[3]。因此，尋找肝癌早期診斷的新分子標(biāo)記、新治療方法或分子靶點(diǎn)尤為必要。

眾所周知，肝癌的發(fā)生、發(fā)展有眾多因素參與，如霉變食物、病毒性肝炎及黃曲霉毒素等[4-5]，且從肝細(xì)胞炎性改變、肝細(xì)胞纖維化和萎縮、肝細(xì)胞不典型增生及肝細(xì)胞癌變的多步驟病理過(guò)程中，有多種癌基因的激活和抑癌基因的失活。研究證實(shí)，在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、分化和侵襲等分子機(jī)制中，SERPINB5(serpin family B member 5)具有重要的生物學(xué)意義，如調(diào)節(jié)細(xì)胞間的粘附，促進(jìn)凋亡，阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成作用[6-10]。

大量研究證實(shí)，化學(xué)藥物聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠HCC模型與人類HCC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程相似，因而化學(xué)藥物聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠HCC模型對(duì)于開展人類HCC研究有著重要的臨床意義[11-14]。本研究采用二乙基亞硝胺(diethylnirtosamine, DEN)和亞硝基嗎啉(N-nitrosomorpholine, NMOR)復(fù)合化學(xué)法誘導(dǎo)F344大鼠HCC模型，對(duì)SERPINB5在大鼠HCC形成過(guò)程中的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分析其與HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為HCC的臨床診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑實(shí)驗(yàn)DEN和NMOR購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，小鼠抗人SERPINB5購(gòu)自Protein tech公司，羊抗鼠二抗SP免疫組化試劑盒和DAB顯色液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2大鼠HCC模型的建立、分組及取材SPF級(jí)F344大鼠80只，雄性，6～8周齡、體質(zhì)量150～200 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。自由飲食和飲水，室溫(26±1)℃，濕度50%～55%，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。全部大鼠隨機(jī)分為化學(xué)誘癌組(50只)和對(duì)照組(30只)。將DEN和NMOR溶解于生理鹽水溶液中，實(shí)驗(yàn)組大鼠稱重后，DEN按100 mg/kg采用腹腔注射法給藥，第2天開始給予0.1 mg/kg NMOR灌胃至20周。正常對(duì)照組只在第1天按體質(zhì)量給予和DEN溶液相同體積的生理鹽水腹腔注射，第2天給予NMOR相同體積的生理鹽水灌胃，第3天以后自由飲食和飲水。觀察大鼠的精神、食欲狀態(tài)、背毛及體質(zhì)量改變等。在首次腹腔注射DEN后的第4、8、12、16、20周，分別從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組隨機(jī)處死大鼠10只和6只。開腹觀察肝臟大體形態(tài)包括大小、質(zhì)地和顏色并取材進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3組織病理學(xué)觀察分別取化學(xué)誘癌組及對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)肝組織，40 g/L多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織的病理形態(tài)變化。

1.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)SERPINB5表達(dá)石蠟切片烘烤脫蠟，脫水后用檸檬酸修復(fù)液進(jìn)行高壓抗原修復(fù)。加30 mL/L H2O2在標(biāo)本上作用10 min以完全去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后孵育一抗SERPINB5(11722-1-AP，1∶100，protein tech)，同時(shí)制作PBS作為陰性對(duì)照，放置4 ℃冰箱過(guò)夜。在室溫條件下，二抗孵育1 h。用DAB底物顯示免疫反應(yīng)產(chǎn)物，蘇木素對(duì)胞核進(jìn)行復(fù)染，透明后中性樹膠封片。結(jié)果判讀由我院病理科兩名主治以上醫(yī)師進(jìn)行，在普通顯微鏡下對(duì)10個(gè)隨機(jī)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的染色強(qiáng)度分級(jí)如下，0：無(wú)染色；1：弱表達(dá)染色；2：中度表達(dá)染色；3：強(qiáng)表達(dá)染色。陽(yáng)性細(xì)胞的百分比所得分?jǐn)?shù)分級(jí)如下，1：<25%；2：26%～50%；3：51%～75%；4：>76%。將上述兩種評(píng)分值相加。根據(jù)總分值，樣本被分為4組，陰性組(-)：被染色的細(xì)胞在總細(xì)胞數(shù)中≤5%，0分；低表達(dá)組(+)：1～3分；中等表達(dá)組()：4～5分；高表達(dá)組()：6～7分。在這些分組中，陰性組和低表達(dá)組被判定為該蛋白陰性表達(dá)，中等表達(dá)組和高表達(dá)組被判定為該蛋白陽(yáng)性表達(dá)。選取陽(yáng)性區(qū)域照相和灰度分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，并行方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1F344大鼠一般狀態(tài)50只化學(xué)誘癌組大鼠在第6周時(shí)出現(xiàn)食欲減退、背毛粗糙、神情倦怠、精神萎靡、反應(yīng)遲緩、體質(zhì)量下降，上述情況均逐漸加重，對(duì)照組30只大鼠幾乎無(wú)上述癥狀，且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均無(wú)死亡，總死亡率為0(0/80)。

2.2F344大鼠不同階段肝臟病理形態(tài)學(xué)改變?cè)谡T癌第4周時(shí)，肉眼可見(jiàn)肝臟大小與正常對(duì)照組無(wú)差異，大小正常，顏色紅潤(rùn)，但質(zhì)地略韌(圖1A)；光鏡下觀察，肝細(xì)胞表面絨毛變平，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞下基底膜形成，內(nèi)皮細(xì)胞上窗孔變小，數(shù)量稍減少(圖2A)。在誘癌第8周時(shí)，肉眼可見(jiàn)肝臟稍腫大，顏色變深紅，質(zhì)地韌；光鏡下觀察，肝細(xì)胞表面絨毛變平，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞下基底膜形成，內(nèi)皮細(xì)胞上窗孔變小，數(shù)量減少，甚至消失。第12周時(shí)，肉眼可見(jiàn)肝臟腫大，顏色進(jìn)一步深紅，質(zhì)地略硬，表面出現(xiàn)微結(jié)節(jié)，灰白色，大小2～4 mm(圖1B)；光鏡下觀察，可見(jiàn)肝臟正常小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)脂肪變性和較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝臟呈典型的炎性表現(xiàn)(圖2B)。第16周時(shí)，肉眼可見(jiàn)肝臟稍縮小，顏色變?yōu)榘导t色，質(zhì)地硬，表面微結(jié)節(jié)明顯增大，直徑在5～20 mm不等，與周圍組織分界不清(圖1C)；光鏡下觀察，見(jiàn)癌細(xì)胞微浸潤(rùn)，癌周肝組織假小葉多見(jiàn)并有明顯纖維組織增生，呈現(xiàn)典型的肝硬化表現(xiàn)(圖2C)。第20周時(shí)，肉眼可見(jiàn)肝臟縮小，顏色呈黑褐色，質(zhì)地堅(jiān)硬，癌結(jié)節(jié)較前增大和增多，部分融合(圖1D)；光鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞排列紊亂，失去正常條索狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核比例增大，染色深，核質(zhì)比例增大，可見(jiàn)瘤巨細(xì)胞和病理性核分裂相，其間大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，呈典型肝癌表現(xiàn)(圖2D)。

圖1F344大鼠不同階段肝臟的大體標(biāo)本

Fig.1 Gross liver specimen in F344 rats at different stages

A：正常對(duì)照組4周；B：誘癌組12周；C：誘癌組16周；D：誘癌組20周。

圖2F344大鼠不同階段肝臟的組織形態(tài)

Fig.2 Histology of liver tissue in F344 rats at different stages (×100)

A：正常對(duì)照組4周；B：誘癌組12周；C：誘癌組16周；D：誘癌組20周。

2.3F344大鼠不同階段肝組織內(nèi)SERPINB5蛋白表達(dá)的變化蛋白陽(yáng)性的樣本行圖像分析，測(cè)其灰度值作為其表達(dá)強(qiáng)度的量化指標(biāo)，灰度值與實(shí)際表達(dá)強(qiáng)度成反比，即灰度值越低，陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)，灰度值越高，陽(yáng)性表達(dá)越弱(圖3)。正常對(duì)照組大鼠肝組織內(nèi)SERPINB5主要表達(dá)于胞質(zhì)，呈棕色，細(xì)胞膜和細(xì)胞核未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)(圖4A)；誘癌組第12周時(shí)，呈典型的炎性改變，且SERPINB5的表達(dá)在胞質(zhì)呈淡棕色，SERPINB5表達(dá)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4B)；誘癌組第16周時(shí)，呈典型的肝硬化表現(xiàn)，并伴有癌細(xì)胞微浸潤(rùn)，此時(shí)，相應(yīng)可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)SERPINB5表達(dá)大量減少，呈黃色著色，明顯低于誘癌第12周(P<0.05，圖4C)；誘癌組第20周時(shí)，細(xì)胞的異型性更加明顯，且癌細(xì)胞大量浸潤(rùn)，細(xì)胞質(zhì)SERPINB5表達(dá)進(jìn)一步大量減少，胞質(zhì)呈淡黃色著色，與誘癌第16周比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4D)。

圖3F344大鼠不同階段肝組織內(nèi)SERPINB5蛋白灰度值的變化

3 討 論

大多數(shù)亞洲地區(qū)的原發(fā)性HCC是建立在病毒性肝炎基礎(chǔ)之上，而歐美國(guó)家的HCC是以酒精性肝炎或脂肪性肝炎為發(fā)病原因，因此針對(duì)不同的病因，世界各地的研究者采用不同的肝癌動(dòng)物模型來(lái)研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、診斷及治療等。本課題組已在先前的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用DEN+NMOR誘導(dǎo)成功建立了具有一定轉(zhuǎn)移潛能的大鼠肝癌動(dòng)物模型[15]。該模型操作簡(jiǎn)便、成瘤周期短、效果確切，能大批量誘發(fā)出相對(duì)穩(wěn)定的肝臟腫瘤，并有一定的肺轉(zhuǎn)移率，病理過(guò)程遵循損傷、炎癥、硬化和肝癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的一般規(guī)律，與人肝癌生物學(xué)特性相似。在本實(shí)驗(yàn)中，我們同樣觀察到上述類似結(jié)果，說(shuō)明該模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，是研究人類肝癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的一種較好的動(dòng)物模型。

SERPINB5也稱maspin，是1994年ZOU等使用消減雜交法和差異顯示分析技術(shù)，在對(duì)正常乳腺和乳腺癌組織比較時(shí)發(fā)現(xiàn)的候選腫瘤抑制蛋白。

圖4F344大鼠不同階段肝組織內(nèi)SERPINB5蛋白的表達(dá)情況

Fig.4 Expression of SERPINB5 protein in liver tissues of F344 rats at different stages (×100)

A：正常對(duì)照組4周；B：誘癌組12周；C：誘癌組16周；D：誘癌組20周。

該蛋白有一個(gè)活性位點(diǎn)環(huán)位于C端附近，N端可以辨別靶蛋白，啟動(dòng)子區(qū)含有各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中C端易受影響，若發(fā)生肽鍵斷裂，就會(huì)影響SERPINB5蛋白發(fā)揮各種有效的生物學(xué)功能[16]。研究發(fā)現(xiàn)，SERPINB5的亞細(xì)胞定位與患者的預(yù)后密切相關(guān)，在乳腺癌和卵巢癌中研究的最多，提示SERPINB5在細(xì)胞核中表達(dá)的患者預(yù)后較好，而在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的患者則預(yù)后較差[17-19]。近期有學(xué)者通過(guò)多個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了系統(tǒng)Meta分析和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SERPINB5的表達(dá)水平與胃癌患者的浸潤(rùn)深度、TNM分期、分化程度、腸型癌、彌漫型癌及總生存期均呈負(fù)相關(guān)[20]。上述研究結(jié)果與本課題組前期對(duì)人肝癌標(biāo)本的研究結(jié)果一致[21]。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)免疫組織化學(xué)法觀察發(fā)現(xiàn)，SERPINB5幾乎均表達(dá)于大鼠肝臟的胞質(zhì)中，且隨著肝組織在炎癥、肝硬化及肝癌的病理變化進(jìn)展中，其表達(dá)逐漸減少,這與本課題前期在人肝臟組織標(biāo)本中研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，我們推測(cè)SERPINB5可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其可能是肝癌早期診斷的一個(gè)新分子標(biāo)記或是肝癌治療的新靶點(diǎn)。當(dāng)然，這種推測(cè)還需要大量的臨床實(shí)踐研究來(lái)支持和驗(yàn)證。本研究為SERPINB5在肝癌的早期診斷和治療方面奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。