王吉昌，李雄雄，李光月

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院：1. 血管外科；2. 乳腺外科；3. 科技部，陜西西安 710061)

CD8陽性T細胞是人體T淋巴細胞群中非常重要的一群細胞，在介導機體細胞免疫中發(fā)揮極其重要的作用。目前，在眾多腫瘤治療的研究方向中，以增強CD8陽性T細胞殺傷腫瘤細胞為基礎的免疫療法被認為是一種可能治愈腫瘤的方法。而抗腫瘤免疫中，只有當CD8陽性T細胞浸潤到腫瘤內(nèi)部才可能通過接觸性殺傷導致腫瘤細胞凋亡。研究表明，CD8陽性T細胞向包括腫瘤在內(nèi)的組織內(nèi)浸潤的程度與腫瘤的灌注情況存在密切關系。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，抗代謝異常藥物二甲雙胍可增加惡性腫瘤內(nèi)部的血液灌注，從而抑制腫瘤的嚴重缺氧。近來有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以增加CD8陽性T細胞在腫瘤內(nèi)的浸潤數(shù)量。而關于二甲雙胍介導的增強CD8陽性T細胞浸潤與增加的腫瘤灌注是否有關，目前仍不十分清楚。本研究通過檢測原位小鼠4T1乳腺癌中CD8陽性T細胞的浸潤數(shù)量、腫瘤灌注情況及兩者間的相關性，探討二甲雙胍介導的增加腫瘤灌注與增強CD8陽性T細胞浸潤之間的關系。

1 材料與方法

1.1細胞、動物及試劑6～8周雌性BALB/C小鼠20只，體質(zhì)量16～20 g，全部由西安交通大學醫(yī)學動物實驗中心提供。本研究所涉及動物實驗通過西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核。兔抗小鼠CD8抗體購自上海生工生物工程有限公司；TRITC標記的Lectin由Vector Labs公司提供；Fitc標記的山羊抗兔二抗購自Invitrogen公司；Dapi核復染試劑購自Sigma公司；40 g/L多聚甲醛及PBS購自西安壯志生物有限公司；胎牛血清蛋白及DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；實驗用二甲雙胍粉劑及Triton X-100購自Sigma公司；4T1小鼠轉移性乳腺癌細胞購于空軍軍醫(yī)大學細胞庫；OCT冰凍標本包埋劑購自日本櫻花公司。

1.2細胞準備4T1小鼠乳腺癌細胞使用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM進行培養(yǎng)。并連續(xù)傳代3代后行分皿培養(yǎng)。當細胞生長融合接近80%～90%時，用PBS充分沖洗后，胰蛋白酶消化細胞。鏡下觀察視野內(nèi)多數(shù)細胞變圓并開始脫離培養(yǎng)皿底板時，終止消化。離心后棄去上清，并使用PBS沖洗后再次清洗后離心。棄去PBS上清后使用不含胎牛血清蛋白的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，經(jīng)細胞計數(shù)后將懸液中細胞密度調(diào)整至1×106/mL，置于冰上備用。

1.3原位乳腺癌模型構建及動物分組原位接種細胞前用移液器充分重懸細胞。用胰島素針穿刺BALB/C小鼠的第四對乳腺的脂肪墊，并注射細胞懸液100 μL。接種后第9天平均腫瘤體積達到50 mm3時，將20只小鼠隨機分為對照組和二甲雙胍組。對照組小鼠給予普通飲用水，干預組小鼠給予含有二甲雙胍的飲用水。小鼠平均飲水量為3 mL/d。二甲雙胍干預劑量為250 mg/kg。

1.4血管灌注實驗及標本準備連續(xù)干預2周后，使用10 g/L戊巴比妥鈉麻醉小鼠。后經(jīng)尾靜脈注射TRITC-Lectin共約100 μL。15 min后過量注射戊巴比妥鈉處死小鼠后，經(jīng)心臟灌注40 g/L多聚甲醛約50 mL，完整提取腫瘤組織，并于40 g/L多聚甲醛中避光固定約4 h。后使用200～300 g/L蔗糖溶液對標本行避光脫水后吸干，并使用OCT包埋劑包埋標本，后置于-80 ℃?zhèn)溆?。?22 ℃下進行切片，厚度約6 μm，于-80 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5免疫熒光染色冰凍切片經(jīng)PBS清洗和2 mL/L Triton X-100溶液透膜，再次清洗后用50 g/L BSA于37 ℃下封閉切片30 min。甩掉BSA后滴加CD8抗體(工作液稀釋比為1∶90)，于4 ℃下孵育過夜后，PBS清洗并滴加Fitc標記的熒光二抗，室溫孵育1 h，清洗并復染Dapi。充分清洗切片后，使用蓋玻片及抗熒光淬滅劑封片。避光37 ℃下烘干1 h，Leica共聚焦熒光顯微鏡下記錄染色結果。

1.6CD8陽性T細胞浸潤程度及灌注程度測定熒光共聚焦顯微鏡下連續(xù)觀察10個視野(同時記錄紅色信號的灌注圖像)，記錄每個視野中的CD8陽性T細胞(綠色熒光)的數(shù)量，并取平均值作為每一個標本的平均CD8陽性T細胞浸潤數(shù)量，并換算計量為數(shù)量/mm2。灌注情況的測定：首先取與測量CD8陽性T細胞浸潤數(shù)量視野相對應的紅色熒光信號視野。使用ImageJ軟件測量紅色Lectin陽性信號的面積，10個視野的平均值作為每個標本的Lectin陽性信號面積(即腫瘤血管的灌注面積)，并最終換算為μm2的計量形式。

1.7統(tǒng)計學分析使用Graphpad Prism5進行統(tǒng)計學分析。比較計量資料之前，行Levene方差齊性檢驗。兩組間的計量資料采用獨立樣本的t檢驗進行分析。每一標本的CD8陽性T細胞浸潤數(shù)量及相應的Lectin陽性信號面積用于進行相關性分析，采用Spearman Correlation方法進行統(tǒng)計學分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1二甲雙胍增加CD8陽性T細胞的浸潤數(shù)量對照組和二甲雙胍干預組腫瘤組織內(nèi)CD8陽性T細胞(綠色信號)數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義(t=4.707，P<0.001)。兩組結果的Levene方差齊性檢驗P>0.05，提示方差齊。結果分析顯示，二甲雙胍干預組小鼠4T1乳腺癌腫瘤組織內(nèi)浸潤的CD8陽性T細胞數(shù)量[(120.8±26.9)個/mm2]顯著高于對照組[(67.9±22.9)個/mm2](圖1、圖2，表1)，這提示持續(xù)二甲雙胍干預明顯增加了小鼠乳腺癌中的CD8陽性T細胞的浸潤數(shù)量。

圖1對照組4T1腫瘤內(nèi)部僅可見少量浸潤CD8陽性T細胞及Lectin灌注區(qū)域

Fig.1 Only a small number of CD8+T cells and lectin-perfused area were found in the untreated 4T1 cancer

綠色熒光：CD8抗體染色；紅色信號：預先經(jīng)心臟灌注的Lectin；藍色：Dapi核染色。標尺：100 μm。

2.2二甲雙胍可增加4T1腫瘤灌注對照組及二甲雙胍干預組4T1腫瘤內(nèi)部的Lectin陽性信號面積差異有統(tǒng)計學意義(t=3.494，P=0.003)。兩組數(shù)據(jù)方差齊性(Levene檢驗P>0.05)。二甲雙胍干預組4T1腫瘤內(nèi)的Lectin陽性面積[(18 357.0±5 865.0)像素/μm2]顯著高于對照組[(10 233.0±4 434.0)像素/μm2](圖1、圖2，表1)。這提示二甲雙胍可增強腫瘤血液灌注。

圖2二甲雙胍組增加4T1腫瘤內(nèi)部的Lectin灌注區(qū)域及浸潤的CD8陽性T細胞數(shù)量

Fig.2 Metformin administration increased lectin-perfused area and the infiltrated CD8+T cells inside 4T1 cancer

白色箭頭：伴隨血流灌注進入腫瘤內(nèi)部的CD8陽性T細胞；綠色熒光：CD8抗體染色；紅色信號：預先經(jīng)心臟灌注的Lectin；藍色：Dapi核染色。標尺：100 μm。

表1各組4T1腫瘤內(nèi)部CD8陽性T細胞浸潤數(shù)量及被Lectin灌注的信號面積

Tab.1 Number of CD8+T cells infiltrated in the 4T1 cancer and lectin-perfused tumor area in each group

參數(shù)對照組二甲雙胍干預組tPCD8+ T cells(n/mm2)67.9±22.9120.8±26.94.50.001Lectin+信號(μm2)10233.0±4434.018357.0±5865.03.50.003

2.3CD8陽性T細胞通過血流進入腫瘤內(nèi)部二甲雙胍干預組的4T1腫瘤中，觀察顯示有3個CD8陽性T細胞與紅色Lectin信號共定位；其中有1個細胞的一側已經(jīng)突出Lectin信號的邊界以外，提示該細胞可能正在從灌注血管內(nèi)向腫瘤實質(zhì)內(nèi)發(fā)生遷移(圖2)。這提示外周血中的CD8陽性T細胞可通過血流灌注進入腫瘤內(nèi)部并最終進入腫瘤實質(zhì)，進而發(fā)揮殺傷作用。

2.4腫瘤灌注面積與CD8陽性T細胞浸潤數(shù)量呈線性相關對CD8陽性T細胞浸潤數(shù)量及Lectin灌注面積進行Spearman Correlation分析。兩組的CD8陽性T細胞浸潤數(shù)量與Lectin灌注面積均呈線性相關(圖3)。二甲雙胍干預組的相關系數(shù)R為0.884，P=0.007；非干預組的相關系數(shù)R為0.928，P<0.001(圖3)。

3 討 論

二甲雙胍是臨床治療2型糖尿病的傳統(tǒng)藥物，其良好的耐受性及低毒性一度使其成為首選治療[1]。隨著研究的不斷深入，科學家們在臨床前實驗研究中逐漸發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有顯著抑制腫瘤生長的作用。此外，基于人群的數(shù)據(jù)研究證實：服用二甲雙胍的糖尿病患者多個系統(tǒng)的腫瘤發(fā)生率低于未服用組患者[2]。

圖34T1腫瘤內(nèi)部的CD8陽性T細胞浸潤數(shù)量與Lectin灌注面積呈線性相關

Fig.3 The number of CD8+T cells infiltrated in the 4T1 cancer was linearly correlated with lectin-perfused area

A：對照組；B：二甲雙胍干預組。SpearmanR為相關系數(shù)。

但是，有關二甲雙胍發(fā)揮抗腫瘤的具體作用仍不十分清楚。本研究通過構建原位小鼠乳腺癌模型并用二甲雙胍持續(xù)干預2周，發(fā)現(xiàn)可增加腫瘤的灌注水平及腫瘤內(nèi)CD8陽性T細胞的浸潤水平。大量研究數(shù)據(jù)已證實，腫瘤內(nèi)CD8陽性T細胞的浸潤數(shù)量與患者的預后密切相關[3]。因此，本研究結果對目前仍不十分清楚的二甲雙胍抗腫瘤機制是一個重要補充。

本課題組前期研究中已發(fā)現(xiàn)：小劑量二甲雙胍[<100 mg/(kg·d)]僅僅產(chǎn)生輕微的抗腫瘤作用。由于CD8陽性細胞的主要作用在于直接殺傷腫瘤細胞，因此，本研究不適合用小劑量進行干預觀察，而所使用的劑量[250 mg/(kg·d)]是根據(jù)物種藥物劑量換算公式(根據(jù)體表面積)換算所得。該劑量與臨床劑量相匹配，從而能更好用于闡明二甲雙胍的抗腫瘤機制，并使研究結果更具外推性。

CD8陽性T細胞是機體對抗腫瘤進展的一種重要因素[4]。CD8陽性T細胞主要通過接觸性殺傷對腫瘤發(fā)揮作用，因此，腫瘤組織內(nèi)的CD8陽性T細胞的浸潤數(shù)量對于機體抗腫瘤作用至關重要。近來有研究證實：二甲雙胍可通過增加腫瘤內(nèi)的CD8陽性T細胞的浸潤數(shù)量而發(fā)揮抗腫瘤作用[5-6]。本研究再次證實上述結果，并且進一步通過相關性分析的結果顯示，增加的CD8陽性T細胞的浸潤數(shù)量與增加的腫瘤灌注之間存在密切相關性。事實上，在機體處于免疫激活狀態(tài)時，比如在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，大量T細胞在胸腺中成熟后進入血液，并隨血流進入病灶從而發(fā)揮免疫作用[7]。因此，在二甲雙胍干預下產(chǎn)生的腫瘤灌注的改善可使更多的外周CD8陽性T細胞浸潤到腫瘤內(nèi)部。

本研究發(fā)現(xiàn)的二甲雙胍增加腫瘤血流灌注可能具有更重要的意義。目前比較認可的觀點是腫瘤在早期生長時就出現(xiàn)缺氧[8-9]。缺氧可以通過抑制腫瘤免疫、介導放化療抵抗的機制以進一步促進腫瘤進展[10]。因此，二甲雙胍通過增加腫瘤灌注帶來的治療意義不應該僅僅被局限于增加CD8陽性T細胞浸潤。

本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有抑制腫瘤異常血管生成的作用[11]。而對于二甲雙胍是否對腫瘤血管的功能和結構狀態(tài)產(chǎn)生影響則未進行深入報道。本研究的結果至少說明二甲雙胍具有增強腫瘤血管功能狀態(tài)的作用。據(jù)報道，血管功能與血管的成熟度密切相關，即與血管內(nèi)皮層被血管平滑肌細胞包被的程度有關[12-13]。而且課題組新近發(fā)表的文章已經(jīng)證實，二甲雙胍具有改善腫瘤血管成熟度的作用[14]，這也提示是血管功能得到改善的原因。

綜上所述，本研究結果提示，二甲雙胍介導的增強CD8陽性T細胞腫瘤浸潤的作用與其產(chǎn)生的改善腫瘤灌注的作用密切相關。