張巍，林江，陳巧云，錢震，克曉燕，錢軍

（1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212002；3.北京大學(xué)第三醫(yī)院血液內(nèi)科，北京100191）

T細(xì)胞活化需要雙信號系統(tǒng)：第一信號為“抗原肽—主要組織相容性復(fù)合體—T細(xì)胞抗原受體”構(gòu)成的抗原特異性識別信號；第二信號為協(xié)同刺激信號，主要由抗原遞呈細(xì)胞表面的B7共刺激分子和CD28分子介導(dǎo)。目前已發(fā)現(xiàn)十余個(gè)B7家族成員，在淋巴和非淋巴器官均有表達(dá)，與相應(yīng)受體結(jié)合通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞從而參與抗腫瘤免疫；一些負(fù)性共刺激分子在人類多種腫瘤組織中異常表達(dá)，與腫瘤的生物學(xué)特性及患者預(yù)后密切相關(guān)，還可通過非免疫調(diào)控作用直接參與腫瘤形成［1-2］。多種腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)胞膜HLA-Ⅰ類分子表達(dá)，減弱CD8+T細(xì)胞識別腫瘤的能力；通過下調(diào)胞膜HLA-Ⅱ類分子表達(dá)，削弱CD4+T細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞或內(nèi)化抗原肽的能力，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸［3］。然而，B7家族分子、HLA抗原在惡性血液病中的表達(dá)特征及意義尚未完全闡明，不同類型血液腫瘤中具體何種B7分子可作為其分子靶標(biāo)尚不清楚。因此，本研究選取13種人類惡性血液病細(xì)胞株并以12例健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）作為對照，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測 B7.1、B7.2、HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分子，B7-H1、CD279、B7-H3和 B7-H4膜蛋白表達(dá)以及B7-H1、B7-H3和B7-H4等胞質(zhì)和（或）胞核蛋白表達(dá)，為進(jìn)一步研究B7分子在惡性血液病中的作用及靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

澳洲胎牛血清（美國 HyClone公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基、IMDM（美國Gibco公司）；PE標(biāo)記抗人B7.1單克隆抗體（克隆 L307.4）、FITC標(biāo)記抗人B7.2單克隆抗體［克隆2331（FUN-1）］、FITC標(biāo)記抗人HLA-Ⅰ單克隆抗體（克隆G46-2.6）、APC標(biāo)記抗人HLA-Ⅱ單克隆抗體（克隆G46-6）、PE標(biāo)記抗人B7-H1單克隆抗體（克隆MIH1）和相應(yīng)同型對照抗體（美國BD公司）；APC標(biāo)記抗人CD279單克隆抗體（克隆J105）、APC標(biāo)記抗人B7-H3單克隆抗體（克隆7-517）、PE標(biāo)記抗人B7-H4單克隆抗體（克隆H74）和相應(yīng)同型對照抗體（美國eBioscience公司）。固定破膜試劑盒BD IntraSureTM試劑盒（美國BD公司），固定破膜試劑盒Foxp3／轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液試劑盒（美國eBioscience公司）。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

人急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞株、人急性單核細(xì)胞白血病U937細(xì)胞株、人慢性髓系白血病K562細(xì)胞株、人Burkitt淋巴瘤Raji和CA46細(xì)胞株、Maver和Z138（人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株）、Jurkat、JurkatE6-1和 Molt-4（人 T淋巴母細(xì)胞白血?。馨土黾?xì)胞株）、Hut-78（人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株）和YTS（人NK／T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株）購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC）。人多發(fā)性骨髓瘤CZ1細(xì)胞株由上海長征醫(yī)院惠贈。

HL-60、U937、K562、Raji、Z138、Jurkat、Jurkat E6-1、Molt-4、和CZ1細(xì)胞株分別于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL及鏈霉素100μg／mL）中培養(yǎng)。CA46、Hut-78和 YTS細(xì)胞株分別于RPMI-1640培養(yǎng)基（含20%胎牛血清、青霉素100 U／mL及鏈霉素100μg／mL）中培養(yǎng)。Maver培養(yǎng)于IMDM中（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL及鏈霉素100μg／mL）。上述細(xì)胞株均在37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d換液及傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 健康體檢者血樣的采集與處理

本研究分別經(jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院和北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會審批通過。簽訂知情同意書后，分別抽取12例健康志愿者空腹肘前靜脈血進(jìn)行檢測。志愿者中男女各6例，年齡19～40歲，均無血液、心、肝、腎、消化、神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病和代謝異常等病史，無近期手術(shù)史，采血前1個(gè)月內(nèi)及采血期間未服用任何藥物，采血期間禁煙、酒及含咖啡因飲料，于北京大學(xué)第三醫(yī)院體檢中心進(jìn)行常規(guī)健康體檢均合格。

血樣的處理：采集上述志愿者肝素抗凝外周血4 mL，加入4 mL PBS混勻，將稀釋后血液緩慢加至8 mL人淋巴細(xì)胞分離液面上，400×g離心20 min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，PBS洗滌后重懸備用。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測B7共刺激分子的表達(dá)及亞細(xì)胞定位

1.4.1 B7分子和HLA抗原膜蛋白水平檢測 分別取12例健康志愿者PBMCs和13株人類惡性血液病細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL。分別加入20μL B7.1、20μL B7.2、20μLHLA-Ⅰ、20μLHLA-Ⅱ、20 μL B7-H1、5μL CD279、5μL B7-H3和5μL B7-H4的單克隆抗體以及相應(yīng)同型對照抗體，室溫避光孵育30 min。鞘液洗滌2次后，流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算表達(dá)率和相對表達(dá)，相對表達(dá)以平均熒光強(qiáng)度（MFI）計(jì)算，陽性表達(dá)分：“++”，即lg目的分子MFI值／lg同型對照MFI值≥2；“+”，即lg目的分子MFI值／lg同型對照MFI值＜2。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4.2 3種負(fù)性B7分子胞質(zhì)蛋白水平檢測 應(yīng)用BD公司固定破膜試劑盒，將上述單細(xì)胞懸液分別加入100μL破膜劑A液，室溫避光孵育5min；鞘液洗滌1次后，加入50μL破膜劑B液，再分別加入20μL B7-H1、5μL B7-H3和5μL B7-H4的單克隆抗體以及相應(yīng)同型對照抗體，室溫避光孵育30 min。鞘液洗滌2次后，流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算表達(dá)率。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4.3 3種負(fù)性B7分子胞核及胞質(zhì)蛋白水平檢測應(yīng)用eBioscience公司固定破膜試劑盒，將上述單細(xì)胞懸液分別加入1 mL破膜劑工作液（固定／破膜濃縮液與固定／破膜稀釋液以1∶3比例混合），室溫避光孵育30 min；再加入1 mL破膜緩沖液工作液（10×破膜緩沖液以1∶10比例稀釋），室溫避光孵育20 min。離心后鞘液重懸細(xì)胞，分別加入20μL B7-H1、5μL B7-H3和5μL B7-H4的單克隆抗體以及相應(yīng)同型對照抗體，室溫避光孵育30 min。鞘液洗滌2次后，流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算表達(dá)率。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩相互比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人類惡性血液病細(xì)胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示（圖1、表1），12例健康受試者 PBMCs中，中性粒細(xì)胞（PBN）、單核細(xì)胞（PB Mo）、淋巴細(xì)胞（PB L）均不表達(dá)B7.1；大部分單核細(xì)胞和小比例PB N表達(dá)B7.2，相對表達(dá)偏低；除PBN不表達(dá)HLA-Ⅱ類分子外，PBMCs均表達(dá)HLA抗原，其中HLA-Ⅰ類分子的相對表達(dá)明顯較高。人類惡性血液病細(xì)胞株中，B7.1在急性髓系白血?。℉L-60和U937）和T細(xì)胞白血?。馨土黾?xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，在 B細(xì)胞淋巴瘤 （Raji、CA46、Maver和Z138）、CZ1和 K562中表達(dá)豐度較高；B7.2除在髓系白血?。║937和K562）中低表達(dá)、T淋巴母細(xì)胞白血病／淋巴瘤中不表達(dá)外，其余細(xì)胞中均表達(dá)或高表達(dá)；HLA抗原在多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)率和相對表達(dá)均較高，以HLA-Ⅰ類分子最顯著（僅K562不表達(dá)）；HLA-Ⅱ類分子在U937和HL-60中近半數(shù)表達(dá)而相對表達(dá)偏低，在K562以及T淋巴母細(xì)胞白血病／淋巴瘤細(xì)胞中不表達(dá)，其余細(xì)胞均高表達(dá)。

圖1 人類惡性血液病細(xì)胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表達(dá)

對同一腫瘤來源的細(xì)胞株而言，4種分子膜蛋白在3株T淋巴母細(xì)胞白血病／淋巴瘤細(xì)胞中、HLA抗原在4株B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)均一致。而B7.1和B7.2在B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中存在差異：在Burkitt淋巴瘤來源的Raji中，兩種分子表達(dá)均較CA46明顯升高（t＝22.163，P＝0.000和 t＝3.055，0.038）；套細(xì)胞淋巴瘤來源的Maver和Z138相比，B7.1在 Maver中表達(dá)較高（t＝5.978，P＝0.004），B7.2則在 Z138中表達(dá)較高（t＝-29.968，P＝0.000）。

2.2 人類惡性血液病細(xì)胞株中B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4膜蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示（圖2、表2），12例健康受試者中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均不表達(dá)B7-H1及其受體CD279、B7-H3和B7-H4。4種分子的膜蛋白僅在少數(shù)惡性血液病細(xì)胞株中表達(dá)：B7-H1僅在Hut-78和Maver中有極低水平表達(dá)，其余細(xì)胞均不表達(dá)。CD279在YTS、套細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)率和相對表達(dá)均較高，在CZ1和Hut-78中分別檢測到高和低表達(dá)、但相對表達(dá)偏低，其余細(xì)胞則不表達(dá)。B7-H3的表達(dá)率在U937中最高，Maver和Z138中較高，K562和Hut-78中較低；相對表達(dá)則在U937和Maver中明顯較高、在Z138、K562和Hut-78中偏低，其余細(xì)胞則不表達(dá)。B7-H4僅在HL-60細(xì)胞中檢測到低水平表達(dá)，其余細(xì)胞均不表達(dá)。

表1 人類惡性血液病細(xì)胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表達(dá)±s，%

表1 人類惡性血液病細(xì)胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表達(dá)±s，%

B7.1 B7.2 HLA-ⅠHLA-Ⅱ表達(dá)率 相對表達(dá) 表達(dá)率 相對表達(dá) 表達(dá)率 相對表達(dá) 表達(dá)率 相對表達(dá)中性粒細(xì)胞 0.17±0.13 - 11.06±1.68 + 99.96±0.04 ++ 0.62±0細(xì)胞株.11 -單核細(xì)胞 0.30±0.05 - 88.47±1.42 + 99.87±0.06 ++ 97.07±0.25 ++淋巴細(xì)胞 1.07±0.12 - 0.56±0.04 - 99.94±0.06 ++ 46.76±1.50 +HL-60 0.16±0.22 - 82.97±2.13 ++ 99.85±0.13 ++ 43.90±2.22 +U937 0.16±0.15 - 12.32±2.35 + 99.90±0.01 ++ 55.83±5.15 +K562 28.79±2.22 + 11.22±0.30 + 0.62±0.06 - 0.70±0.03 -Raji 88.42±2.73 ++ 88.81±1.37 ++ 96.14±1.31 ++ 99.62±0.36 ++CA46 27.07±3.94 + 68.94±11.19 ++ 100.00±0.00 ++ 99.95±0.04 ++Maver 78.94±8.69 ++ 22.46±3.09 + 99.92±0.06 ++ 97.57±2.17 ++Z138 41.48±6.48 + 80.15±1.26 + 99.99±0.00 ++ 93.84±5.35 ++Jurkat 0.89±1.74 - 3.82±1.90 - 99.57±0.08 ++ 1.11±0.40 -JurkatE6-1 0.67±0.94 - 6.07±3.05 - 99.77±0.23 ++ 1.72±2.37 -Molt-4 0.13±0.05 - 1.98±1.95 - 99.32±0.29 ++ 0.46±0.28 -Hut-78 10.82±4.41 + 87.25±4.18 + 97.66±2.33 ++ 99.39±0.60 ++YTS 1.03±0.38 - 25.70±2.89 + 99.55±0.15 ++ 99.89±0.07 ++CZ1 46.41±4.59 + 96.18±0.59 ++ 74.70±4.47 + 99.76±0.09 ++

圖2 人類惡性血液病細(xì)胞株中B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4膜蛋白的表達(dá)

表2 人類惡性血液病細(xì)胞株中負(fù)性B7相關(guān)分子膜蛋白的表達(dá)±s，%

表2 人類惡性血液病細(xì)胞株中負(fù)性B7相關(guān)分子膜蛋白的表達(dá)±s，%

B7-H1 CD279 B7-H3 B7-H4表達(dá)率 相對表達(dá) 表達(dá)率 相對表達(dá) 表達(dá)率 相對表達(dá) 表達(dá)率 相對表達(dá)中性粒細(xì)胞 1.62±0.25 - 2.83±1.74 - 0.46±0.20 - 1.01±0.84細(xì)胞株-單核細(xì)胞 0.91±0.13 - 3.93±1.25 - 0.64±0.55 - 1.69±0.72 -淋巴細(xì)胞 0.44±0.09 - 5.44±2.52 - 0.23±0.11 - 0.25±0.39 -HL-60 0.19±0.27 - 0.90±0.81 - 0.28±0.30 - 11.92±2.52 +U937 0.23±0.23 - 4.35±2.04 - 95.08±4.12 ++ 2.30±1.26 -K562 0.39±0.02 - 4.96±0.22 - 12.58±2.47 + 2.04±0.31 -Raji 0.36±0.17 - 0.09±0.05 - 1.32±0.47 - 0.70±0.32 -CA46 0.21±0.19 - 1.23±1.22 - 0.12±0.16 - 3.47±1.15 -Maver 6.15±1.29 + 95.89±2.76 ++ 87.46±8.99 ++ 2.02±1.02 -Z138 0.48±0.15 - 90.19±3.76 ++ 80.47±6.12 + 2.38±0.85 -Jurkat 0.33±0.50 - 1.15±0.53 - 0.19±0.16 - 1.23±0.26 -JurkatE6-1 4.16±1.57 - 4.67±2.59 - 1.25±1.73 - 1.74±1.43 -Molt-4 4.73±1.03 - 5.21±2.74 - 0.05±0.04 - 1.42±0.66 -Hut-78 6.81±1.51 + 12.19±6.09 + 10.50±2.82 + 1.18±1.25 -YTS 1.22±0.36 - 98.19±0.13 ++ 1.85±0.82 - 1.67±0.43 -CZ1 0.48±0.27 - 77.25±1.98 + 0.00±0.00 - 0.63±0.42-

2.3 人類惡性血液病細(xì)胞株中B7-H1、B7-H3和B7-H4胞質(zhì)和（或）胞核蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示（圖3），12例健康受試者中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均不表達(dá)3種分子。應(yīng)用BD公司固定破膜試劑盒檢測胞質(zhì)蛋白，結(jié)果顯示僅在U937、Z138和Maver細(xì)胞中有低水平 B7-H3表達(dá)，其余細(xì)胞均不表達(dá)3種分子的胞質(zhì)蛋白。應(yīng)用eBioscience公司固定破膜試劑盒檢測胞核及胞質(zhì)蛋白，發(fā)現(xiàn)B7-H1在細(xì)胞株中均有偏低比例表達(dá)，其中 U937、Molt-4和 CA46的表達(dá)豐度較高。B7-H3除在CZ1中不表達(dá)外，其余12株細(xì)胞中均可檢測出偏低比例表達(dá)，其中Z138和Maver的表達(dá)豐度較高。B7-H4在除CZ1外的12株細(xì)胞中異常高表達(dá)或表達(dá)，其中 Raji和 HL-60表達(dá)豐度最高，Molt-4、Hut-78、Jurkat和 JurkatE6-1表達(dá)居中。

圖3 人類惡性血液病細(xì)胞株中B7-H1、B7-H3和B7-H4胞質(zhì)和（或）胞核蛋白的表達(dá)

同一腫瘤來源的細(xì)胞株中，3種負(fù)性B7分子的胞核及胞質(zhì)蛋白表達(dá)亦存在差異：Burkitt淋巴瘤來源的Raji和CA46相比，B7-H1在CA46中表達(dá)較高（t＝-5.685，P＝0.005），B7-H3表達(dá)無明顯差別（t＝1.761，P＞0.05），B7-H4則在 Raji中表達(dá)較高（t＝11.655，P＝0.000）。套細(xì)胞淋巴瘤來源的Maver和Z138相比，B7-H1在Z138中表達(dá)較高（t＝-3.249，P＝0.031），而 B7-H3和 B7-H4表達(dá)未見明顯差異（t＝-2.710，1.736，P均 ＞0.05）。T淋巴母細(xì)胞白血?。馨土鰜碓吹腗olt-4中，B7-H1表達(dá)較 Jurkat和 JurkatE6-1升高（q＝9.476，12.154，P均＜0.05），而 B7-H3和 B7-H4表達(dá)在3種細(xì)胞中無明顯差別（F＝3.199，3.653，P均 ＞0.05）。

3 討論

B7家族共刺激分子在包括血液病在內(nèi)的多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，通過介導(dǎo)共刺激或共抑制信號，參與抗腫瘤免疫［2］。HLA抗原在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)，致腫瘤抗原提呈能力缺陷，影響T細(xì)胞活化，參與免疫逃逸［3-4］。不同亞細(xì)胞定位的負(fù)性B7分子B7-H1、B7-H3和B7-H4與多種腫瘤惡性程度及患者預(yù)后相關(guān)，可通過非免疫調(diào)控作用直接參與腫瘤形成［5-7］，是新的治療靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B7.1膜蛋白主要表達(dá)于B細(xì)胞淋巴瘤、骨髓瘤細(xì)胞中；B7.2膜蛋白除在T淋巴母細(xì)胞白血?。馨土黾?xì)胞中不表達(dá)外，其余細(xì)胞均表達(dá)或高表達(dá)。這與課題組既往研究結(jié)果一致［8］，提示多數(shù)人類惡性血液病細(xì)胞中，B7.1表達(dá)缺失或下調(diào)可能參與T細(xì)胞抗腫瘤免疫耐受。與多種實(shí)體腫瘤不同，接受標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)免疫治療的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者中，HLA-Ⅰ類分子缺乏不是獨(dú)立預(yù)后因素，HLA-Ⅱ類分子缺乏才與無進(jìn)展生存較短相關(guān)［9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HLA-Ⅰ類分子膜蛋白僅在K562中不表達(dá)，其余細(xì)胞均高表達(dá)；HLA-Ⅱ類分子膜蛋白除在K562及T淋巴母細(xì)胞白血?。馨土黾?xì)胞中不表達(dá)外，其余細(xì)胞亦均表達(dá)或高表達(dá)。這可能與所選細(xì)胞株種類有關(guān)，另外也提示作為T細(xì)胞活化第一信號的重要組分HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分子在多數(shù)人類惡性血液病細(xì)胞中表達(dá)基本正常，可能不是相應(yīng)血液腫瘤發(fā)生的主要原因。近期一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，HLA-Ⅱ類分子膜蛋白表達(dá)陽性的B細(xì)胞淋巴瘤中，HLA-DM的丟失會引起胞膜不變鏈肽段異常表達(dá)，進(jìn)而阻止抗原肽的有效呈遞［10］，此已成為一種新的腫瘤免疫逃逸機(jī)制。因此，T細(xì)胞活化第一信號的不同組分在血液腫瘤中的表達(dá)及意義需作更深入的研究。

既往研究結(jié)果顯示，B7-H1膜蛋白廣泛表達(dá)于間變大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中，而極少表達(dá)于B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中［11］；B7-H3膜蛋白在 27% （30／111）的急性髓細(xì)胞白血病患者腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，其中以M5和M3型最顯著［12］；B7-H4膜蛋白在5株非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株中表達(dá)極少或不表達(dá)［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4膜蛋白在惡性血液病細(xì)胞中普遍低表達(dá)或不表達(dá)，僅CD279在 YTS、Maver、Z138和 CZ1中表達(dá)豐度較高，B7-H3在U937、Maver和Z138中表達(dá)豐度較高；與上述研究基本一致，提示上述B7分子在不同類型血液腫瘤中的作用可能不同，而具體何種分子可作為分子靶標(biāo)仍需進(jìn)行后續(xù)研究。

為進(jìn)一步了解3種負(fù)性分子B7-H1、B7-H3和B7-H4在惡性血液病細(xì)胞中的具體亞細(xì)胞定位，本實(shí)驗(yàn)分別加用兩種破膜劑，結(jié)果顯示，3種分子的胞質(zhì)蛋白基本不表達(dá)，而胞核及胞質(zhì)蛋白則在除CZ1外的細(xì)胞株中異常表達(dá)或高表達(dá)，因此這3種分子主要定位于惡性血液病細(xì)胞核，與課題組既往研究結(jié)果一致［14］，進(jìn)一步提示3種分子的胞核異常分布可能是參與血液腫瘤進(jìn)展的重要因素；后續(xù)擬加用共聚焦顯微成像術(shù)、免疫組化等多種檢測方法深入研究。3種分子亞細(xì)胞定位不同，其臨床意義也不同：接受治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和前列腺癌患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞中，B7-H1表達(dá)于胞膜和（或）胞質(zhì)及胞核，僅胞核表達(dá)與患者預(yù)后較差相關(guān)［5］。部分結(jié)直腸癌患者中，B7-H3表達(dá)于腫瘤細(xì)胞核，且豐度與患者預(yù)后負(fù)相關(guān)［15］；而另一部分患者中，B7-H3主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜及基質(zhì)中，胞核表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)而與TNMⅠ期患者無復(fù)發(fā)生存率降低相關(guān)［6］。與早期肺腺癌患者相比，B7-H4在轉(zhuǎn)移性胸膜腺癌患者的核膜中表達(dá)較高、胞質(zhì)中表達(dá)較低，核膜蛋白水平與Ki-67正相關(guān)，提示患者預(yù)后較差［7］。針對惡性血液病中3種分子的表達(dá)分布如何，特別是胞核表達(dá)是否參與腫瘤形成并與患者預(yù)后相關(guān)，還需后續(xù)進(jìn)行研究。

不同類型的惡性血液病細(xì)胞中，B7分子和HLA抗原的膜蛋白表達(dá)存在明顯差異：急慢性髓系白血病細(xì)胞株存在 B7.1、B7.2、HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分子不表達(dá)或不同程度的低表達(dá)，B7-H1及CD279不表達(dá)，卻不同程度表達(dá)B7-H4和B7-H3。B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株中，B7.1、B7.2、HLA-Ⅰ類和Ⅱ類分子均表達(dá)或高表達(dá)，B7-H1和 B7-H4基本不表達(dá)，CD279和B7-H3在套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中高表達(dá)、而在Burkitt淋巴瘤細(xì)胞中不表達(dá)。T淋巴母細(xì)胞白血病／淋巴瘤細(xì)胞株僅高表達(dá)HLA-Ⅰ類分子，不表達(dá)其余分子。這提示不同類型血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能受不同B7和HLA相關(guān)分子影響，具體各分子參與的權(quán)重有待進(jìn)一步研究。即使同一腫瘤來源的細(xì)胞株，B7分子表達(dá)也存在差別，B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞差異最顯著：Burkitt淋巴瘤來源的Raji和CA46相比，胞膜B7.1、胞膜 B7.2、胞核及胞質(zhì) B7-H4在 Raji中較高，胞核及胞質(zhì)B7-H1在CA46中較高。套細(xì)胞淋巴瘤來源的Maver和Z138相比，胞膜B7.1在Maver中較高，胞膜B7.2、胞核及胞質(zhì)B7-H1在Z138中較高。同種類型惡性血液病中，B7分子的不同表達(dá)水平是否影響腫瘤進(jìn)展及患者預(yù)后，有待進(jìn)一步研究。

綜上，本實(shí)驗(yàn)提示參與免疫逃逸的主要因素可能是B7.1分子表達(dá)缺失或低下，而不是HLA抗原缺乏；負(fù)性B7分子的異常表達(dá)及分布可能影響血液腫瘤進(jìn)展；不同類型及同一腫瘤來源細(xì)胞中B7分子表達(dá)均存在差異，可能涉及腫瘤發(fā)生的相關(guān)機(jī)制。