鈕婧歆，郭晶，郭青，李杰，劉珺，*，劉朝暉，*

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部人體解剖與組織胚胎學(xué)系，江蘇蘇州215123；2.連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，江蘇連云港222007；3.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，江蘇蘇州215009）

帕金森病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，常染色體顯性基因富亮氨酸重復(fù)激酶2（leucine rich repeat kinase 2，LRRK2）基因突變是其發(fā)病的主要原因。LRRK2基因突變后導(dǎo)致黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元丟失和神經(jīng)元內(nèi)路易氏小體沉積。以往研究表明，由遺傳性突變LRRK2結(jié)構(gòu)域第2019位點(diǎn)氨基酸殘基G2019S突變（LRRK2-G2019S）引起的激酶活性增強(qiáng)是導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制［1］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是一種可穿越血腦屏障的中藥單體，能有效保護(hù)腦組織，抑制6-羥多巴胺誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡［2］，還能抑制帕金森病神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）引起的 αsyn聚集和多巴胺能神經(jīng)元損傷［3］。此外，EGCG還具有非常強(qiáng)的抗氧化活性［4］。氧化應(yīng)激是帕金森病發(fā)病的重要原因［5］，由此推測(cè)EGCG對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用可能與其抗氧化活性有關(guān)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明，蛋白激酶C信號(hào)通路與LRRK2激酶活性密切相關(guān)［6］。EGCG對(duì)蛋白激酶C信號(hào)通路有抑制作用，但其對(duì)LRRK2激酶活性是否具有抑制作用尚不清楚。本研究擬探討EGCG對(duì)LRRK2激酶活性的作用及其對(duì)果蠅生物學(xué)行為的影響和相關(guān)分子信號(hào)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

UAS-LRRK2-G2019S品系果蠅為約翰霍普金斯大學(xué)Wanli Smith教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，通過和GAL4雜交獲得 Ddc-Gal4／LRRK2-G2019S品系果蠅（簡稱Ddc-G2019S）。EGCG（上海源葉生物科技有限公司）；LRRK2激酶抑制劑GW5074（美國APExBIO公司）；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）抗氧化劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；鼠抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）單抗（美國 Sigma公司）；兔抗p-LRRK2單克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）單克隆抗體（美國 Aviva Systems Biology公司）；小鼠抗 β-微管蛋白單克隆抗體、兔抗p-p38 MAPK單克隆抗體、兔抗p-ERK單克隆抗體（蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司）；小鼠抗TH單克隆抗體（Millipore公司）。

1.2 果蠅培養(yǎng)基的配制

先配制果蠅標(biāo)準(zhǔn)玉米培養(yǎng)基，用于Ddc-G2019S對(duì)照組果蠅培養(yǎng)；再取適量加入不同藥物，配成不同加藥組果蠅培養(yǎng)基。具體操作：①稱取瓊脂3.3 g，蔗糖25 g放入盛有300 mL冷水的燒杯中，完全溶解后置于加熱磁力攪拌器上；②稱取酵母12 g放入上述燒杯中，完全溶解后加入玉米粉30 g，攪拌均勻；③待溶液沸騰5 min后停止加熱；④待溫度降至75℃左右時(shí)，加入尼泊金甲酯溶液3 mL，丙酸1.5 mL，攪拌均勻；⑤ 溫度降至適宜時(shí)取一部分灌裝果蠅食物管，此為果蠅標(biāo)準(zhǔn)玉米培養(yǎng)基；⑥ 取50 mL培養(yǎng)基 6份，分別加入 10 mmol／L GW5074，10mmol／LNAC，100μmol／L EGCG，1、10和100mmol／L EGCG各50μL，混勻，灌裝果蠅食物管，即為加藥培養(yǎng)基，藥物濃度分別為10μmol／L GW5074，10μmol／L NAC，0.1、1、10和 100μmol／L EGCG。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將Ddc-G2019S果蠅分為7組：對(duì)照組采用標(biāo)準(zhǔn)玉米培養(yǎng)基飼養(yǎng)；GW5074組采用含 10μmol／L GW5074的培養(yǎng)基飼養(yǎng)；NAC組采用含10μmol／L NAC的培養(yǎng)基飼養(yǎng)；其余4組分別采用含0.1、1、10和100μmol／L EGCG的培養(yǎng)基飼養(yǎng)；每組各6管，共42管；每管置入處女蠅25只，于25℃，相對(duì)濕度60%環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.4 果蠅生命周期及行為學(xué)檢測(cè)

各實(shí)驗(yàn)組每管置入處女蠅25只，每組至少2管果蠅，每隔2天換1次培養(yǎng)基。每天統(tǒng)計(jì)果蠅存活數(shù)，直至果蠅全部死亡。

待處女蠅發(fā)育成熟后，開始每周1次行為學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)果蠅運(yùn)動(dòng)能力。成熟果蠅有沿行為學(xué)測(cè)試管管壁向上攀爬的生物學(xué)特性，以10 s內(nèi)越過測(cè)試管中線的果蠅數(shù)量占管內(nèi)果蠅總數(shù)的百分率來表示果蠅運(yùn)動(dòng)能力，數(shù)值越高表明整組果蠅運(yùn)動(dòng)能力越強(qiáng)。具體操作：在未麻醉情況下，將各組的每管果蠅分別轉(zhuǎn)移至另一空培養(yǎng)管中，靜置2～3 min，使之適應(yīng)環(huán)境改變；輕拍管壁使之全部落在管底，統(tǒng)計(jì)10 s內(nèi)爬過行為學(xué)測(cè)試管中線的果蠅數(shù)量；取3次實(shí)驗(yàn)平均值，每兩次實(shí)驗(yàn)間隔5 min。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)果蠅腦蛋白的表達(dá)

依據(jù)果蠅生命周期和行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，篩選出10μmol／L EGCG組，1μmol／L EGCG組，10μmol／L GW5074組，10μmol／L NAC組，與對(duì)照組進(jìn)行比較。在藥效最顯著的時(shí)間段，取各組果蠅腦組織，分析各種蛋白的表達(dá)。具體操作如下。

CO2麻醉后，在顯微鏡下，用尖頭鑷和刀片取果蠅腦組織，每組取4個(gè)，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上研磨，靜置裂解30 min；4°C，12 000 r／min離心15 min，取上清液。BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整上樣量，使各組蛋白總量一致；加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

制備分離膠、濃縮膠，行SDS-PAGE分離蛋白；轉(zhuǎn)至PVDF膜；室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h；將PVDF膜按一抗蛋白分子量剪開放入對(duì)應(yīng)的一抗稀釋液中（p-LRRK2，Nrf2，p-ERK1／2，p-p38 MAPK，TH稀釋比均為1∶800，β-微管蛋白稀釋比為1∶1 000，TBST為抗體稀釋液），4℃孵育過夜；用1×TBST洗膜3次；加入二抗（稀釋比均為1∶2 000），室溫孵育2 h；洗膜后在暗室中加入發(fā)光劑，成像系統(tǒng)顯影。采用Image J軟件處結(jié)果圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件作圖并用單因素方差分析和Bonferroni事后檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組果蠅生命周期比較

與對(duì)照組相比，各組果蠅存活率從第3周開始出現(xiàn)差異，第4周差異進(jìn)一步擴(kuò)大，第5周時(shí)各組存活率出現(xiàn)較大下降。與對(duì)照組相比，10μmol／L EGCG組提高存活率效果始終最明顯，與GW5074組相近，且在第 5、6、7周優(yōu)于 GW5074；1μmol／L EGCG組效果相對(duì)較好，但第6、7周效果明顯下降。與對(duì)照組相比，NAC組果蠅存活率提高，總體作用雖不如GW5074組和10μmol／L EGCG組，但在第 6、7周表現(xiàn)較好；100μmol／L EGCG和 0.1 μmol／L EGCG對(duì)果蠅有一定保護(hù)作用，但效果不及其余4組，與對(duì)照組差異始終不明顯。見圖1。

與對(duì)照組相比，GW5074組、10μmol／L EGCG組和1μmol／L EGCG組半數(shù)生存時(shí)間明顯延長（P＜0.01），NAC組、100μmol／L EGCG組和 0.1 μmol／L EGCG組半數(shù)生存時(shí)間有一定延長（P＜0.05）。進(jìn)一步印證選用10μmol／L和1μmol／L的EGCG延長果蠅壽命效果較好，0.1、100μmol／L EGCG作用不明顯。見圖1。

圖1 果蠅的生命周期檢測(cè)結(jié)果

2.2 果蠅行為學(xué)的變化

由圖2可見，7組果蠅運(yùn)動(dòng)能力在第5周發(fā)生較大變化。與對(duì)照組相比，10μmol／L EGCG組、1 μmol／L EGCG組與 GW5074組第 4、5、6、7周運(yùn)動(dòng)能力均明顯提高（P＜0.05），第5周時(shí)最明顯（P＜0.01）；NAC組在第 4、5、6周運(yùn)動(dòng)能力也有不同程度的提高（P＜0.05），第5周時(shí)最明顯（P＜0.01）；0.1μmol／L EGCG組僅在第4周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；100μmol／L EGCG組與對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，10μmol／L EGCG改善果蠅運(yùn)動(dòng)能力的效果最為突出，1μmol／L EGCG效果較好，0.1、100μmol／L EGCG作用不明顯，各組果蠅第5周時(shí)行為學(xué)變化最顯著。

圖2 果蠅運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)結(jié)果

2.3 EGCG作用后果蠅腦內(nèi)蛋白表達(dá)的變化

由圖3可見，與對(duì)照組相比，10μmol／L和1 μmol／L EGCG組果蠅腦內(nèi) Nrf2、p-ERK1／2、TH蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05或0.01），p-LRRK2、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05或0.01）。與對(duì)照組相比，GW5074組和NAC組果蠅腦內(nèi)p-ERK1／2、TH蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05或0.01），GW5074組 p-LRRK2和 p-p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）。NAC組Nrf2表達(dá)明顯增加（P＜0.01），兩種濃度的EGCG均能促進(jìn)Nrf2表達(dá)，而1μmol／L EGCG作用效果更佳，低濃度EGCG促進(jìn)Nrf2表達(dá)的作用更強(qiáng)，表明EGCG具有很強(qiáng)的抗氧化活性。GW 5074沒有明顯的抗氧化作用。

3 討論

本研究采用人源性LRRK2-G2019S突變轉(zhuǎn)基因果蠅，其腦內(nèi)LRRK2激酶活性增高，是探究EGCG是否具有抑制LRRK2激酶活性作用的良好模型。本研究表明，EGCG能顯著延長LRRK2-G2019S轉(zhuǎn)基因果蠅壽命，改善果蠅運(yùn)動(dòng)能力，以10μmol／L作用效果最顯著，1μmol／L效果較好；各組果蠅第5周時(shí)行為學(xué)變化最顯著；此外，EGCG能增加果蠅腦內(nèi) Nrf2、p-ERK1／2、TH蛋白表達(dá)，降低 p-LRRK2、pp38 MAPK表達(dá)，表明EGCG能有效抑制LRRK2激酶活性，有較好的抗氧化活性，進(jìn)而保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元；其機(jī)制可能與Keap1-Nrf2-ARE和MAPK信號(hào)通路有關(guān)。在Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路中，EGCG通過激活Nrf2，引起Nrf2核轉(zhuǎn)移，繼而提高谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）基因表達(dá)，增加谷胱甘肽合成［7］，產(chǎn)生抗氧化作用，從而提高Ddc-G2019S轉(zhuǎn)基因果蠅腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的抗氧化應(yīng)激能力［8］；在MAPK信號(hào)通路中，EGCG通過抑制p38磷酸化和（或）激活ERK1／2抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。

在哺乳動(dòng)物中，有4個(gè)MAPK信號(hào)途徑與帕金森病有關(guān)，分別是 ERK1／2，p38 MAPK，JNK及ERK5［9］。p38 MAPK、JNK與 LRRK2也有相關(guān)性，但是三者與帕金森病之間的關(guān)系尚不明確。在應(yīng)激狀態(tài)下，LRRK2可激活p38 MAPK和MKK7參與JNK信號(hào)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。ERK1／2參與LRRK2突變引起的神經(jīng)退化的信號(hào)途徑［11］。有研究報(bào)道，EGCG對(duì)MAPK通路也具調(diào)節(jié)作用，可能通過干預(yù)體內(nèi)p38 MAPK信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α［12］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EGCG組p-LRRK2表達(dá)明顯降低，表明其對(duì)LRRK2激酶活性具有抑制作用；同時(shí)，EGCG組p-ERK1／2、p-p38 MAPK表達(dá)明顯增加，由此提示，EGCG可能通過降低LRRK2突變導(dǎo)致的激酶活性，間接調(diào)控p38 MAPK的磷酸化或活化ERK，進(jìn)而對(duì)多巴胺能神經(jīng)元起到保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，EGCG也能同時(shí)增加果蠅腦內(nèi)Nrf2和TH表達(dá)量。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，受Keap1調(diào)控，通過與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）相互作用調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶表達(dá)［13］。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路是機(jī)體抗氧化機(jī)制中最重要的一條信號(hào)通路［14］。GCLC是 Nrf2調(diào)控的下游抗氧化酶［15］，經(jīng) Nrf2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)促進(jìn)谷胱甘肽的合成［7］?，F(xiàn)已證實(shí)，帕金森病患者黑質(zhì)中谷胱甘肽減少約50%，從而致多巴胺能神經(jīng)元易受到多種毒性物質(zhì)的損傷［8］。研究表明，EGCG可通過誘導(dǎo) GCLC基因表達(dá)提高肝星狀細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體谷胱甘肽的水平［16］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EGCG組果蠅腦內(nèi)Nrf2表達(dá)增加，提示EGCG可能通過激活Nrf2，引起其核轉(zhuǎn)移，繼而上調(diào)GCLC基因表達(dá)，增加果蠅腦內(nèi)谷胱甘肽的合成，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，從而保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受帕金森病誘導(dǎo)刺激的影響，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖3 各組果蠅腦內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)

本研究中，EGCG對(duì)LRRK2激酶活性抑制作用雖稍弱于GW5074，但其本身還具有很強(qiáng)的抗氧化活性，雙重作用使EGCG較GW5074更具有作為帕金森病治療藥物的潛力。EGCG作為一種中藥單體是天然提取的化合物，來源廣，安全性高，具有很大的市場(chǎng)價(jià)值。目前關(guān)于EGCG產(chǎn)生LRRK2激酶活性抑制作用的信號(hào)通路研究并不完善，還有待于后續(xù)研究進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)室已培育了一批LRRK2-G2019S系轉(zhuǎn)基因小鼠，將藥物用于轉(zhuǎn)基因小鼠的生物學(xué)研究，聯(lián)合應(yīng)用果蠅與小鼠，發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，能更好地指導(dǎo)臨床藥物選擇，同時(shí)也為中草藥制劑的治療作用機(jī)制添加更多科學(xué)、客觀的實(shí)驗(yàn)資料。

綜上所述，EGCG是一種有效的LRRK2激酶活性抑制劑，具有多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)作用，可能與其調(diào)控Keap1-Nrf2-ARE、MAPK等信號(hào)傳遞有關(guān)。