★ 王世禮 杜玲杰 王麗娟 陳仁燕

(翔宇藥業(yè)股份有限公司 山東 臨沂 276023)

頤神顆粒是翔宇藥業(yè)股份有限公司的獨(dú)家品種，由發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、靈芝及枸杞子三味中藥材分別經(jīng)不同工藝提取、混合、制粒得到，具有補(bǔ)益肝腎，益氣健脾，寧心安神的作用。還可用于肝腎不足，脾氣虛弱所致的腰膝酸軟，神疲體倦，頭暈?zāi)垦＃募率?。腺苷被普遍認(rèn)為是評(píng)價(jià)發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉質(zhì)量的指標(biāo)成分之一[1]，也是控制頤神顆粒的有效成分。目前腺苷含量的檢測(cè)方法有分光光度法[2]、薄層色譜法(TCL)[3]和高效液相色譜法(HPLC)[4-5]等，本論文采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)腺苷含量，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，制定了檢測(cè)限和定量限，為頤神顆粒中腺苷含量提供一種有效、準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器)，MS105DU型電子天平。腺苷對(duì)照品(批號(hào)：110879-200202；來(lái)源:中國(guó)食品藥品檢定研究院)，甲醇(色譜純，美國(guó)天地有限公司)，水為純化水，磷酸二氫鉀、磷酸鈉等試劑均為分析純。頤神顆粒(翔宇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)161201，161202，161203)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取頤神顆粒161201批樣品1g，置于50mL量瓶中，加0.01mol/L磷酸鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品適量，加0.01mol/L磷酸鈉溶液制成每1 ml含腺苷100μg的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量加0.01mol/L磷酸鈉溶液稀釋制成每1ml含腺苷10μg的溶液作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液制備 取缺少發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉藥材的其余處方量藥材，按上述供試品溶液的制備方法制成不含發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉的陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱為 Thermo C18柱(4.6mm × 250mm，5μm)；流動(dòng)相為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-甲醇(85∶15)，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，流速1.0mL/min，柱溫為室溫25℃，進(jìn)樣量為20μL。理論板數(shù)按腺苷峰計(jì)算應(yīng)分別不低于4000 。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液依法測(cè)定腺苷含量。如圖1由試驗(yàn)結(jié)果可知，按腺苷峰計(jì)算理論板數(shù)不低于4000，陰性供試品對(duì)樣品峰檢測(cè)無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

A.對(duì)照品溶液; B.供試品溶液;C.陰性樣品溶液

2.4 線(xiàn)性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.3，0.6，1.0，1.2，1.5，2.0 mL，分別置于6個(gè)10mL量瓶中，加0.01mol/L的磷酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得濃度分別為3.03，6.06，10.10，12.12，15.15，20.20μg/mL 的線(xiàn)性溶液，依法測(cè)定腺苷含量。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，腺苷溶液在3.03～20.20μg/mL內(nèi)，線(xiàn)性方程為：A=68.027C+7.9388，相關(guān)系數(shù)r= 0.99995，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 定量限和檢測(cè)限 取對(duì)照品溶液加0.01 mol/L的磷酸鈉溶液稀釋至腺苷的信噪比約為10左右的濃度作為定量限溶液。取定量限溶液，加0.01mol/L的磷酸鈉溶液稀釋至腺苷的信噪比約為3左右的濃度作為檢測(cè)限溶液，取上述兩種溶液依法測(cè)定腺苷含量。由試驗(yàn)結(jié)果可知，樣品中腺苷的定量限為0.24ng，檢測(cè)限為0.073ng，滿(mǎn)足頤神顆粒腺苷含量檢測(cè)的要求。

2.6 精密度試驗(yàn) 系統(tǒng)精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液測(cè)定腺苷含量，連續(xù)進(jìn)樣5針，并記錄色譜圖。結(jié)果表明：腺苷峰面積的RSD值為0.13%，表明該表明該方法的系統(tǒng)精密度良好。

方法精密度試驗(yàn)：精密稱(chēng)取樣品(批號(hào)：160101)6份，按供試品制備方法制備供試品溶液，依法測(cè)定腺苷，計(jì)算含量為2.61mg/袋，RSD為0.34%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將161201批供試品溶液于室溫條件下放置10 h，分別于0，1，2，4，6，8，10h測(cè)定腺苷含量。結(jié)果表明含量測(cè)定的供試品溶液在室溫條件下放置10h內(nèi)，測(cè)定所得峰面積的RSD為0.22%，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 取161201批(含量為2.61mg/袋)供試品0.5g，置于50ml量瓶中，分別加入腺苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.62，3.23，4.85mL，然后用0.01mol/L磷酸鈉溶液溶解并稀釋至刻度分別作為50%，100%，150%回收率溶液，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。分別同法制三份，測(cè)定腺苷含量。

表1 頤神顆粒含量測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 適用性試驗(yàn)

2.9.1 柱溫 在柱溫分別為20，25，30℃條件下，測(cè)定腺苷含量。結(jié)果表明，柱溫在20～30℃之間變化時(shí)，腺苷含量的RSD為0.83%，柱溫的適用性較好。

2.9.2 流速 在流速分別為0.9，1.0，1.1mL/min條件下，測(cè)定腺苷含量。結(jié)果表明，流速在0.9 ～1.1mL/min之間變化時(shí)，腺苷含量的RSD為0.29%，流速的適用性較好。

2.9.3 流動(dòng)相 在流動(dòng)相磷酸二氫鉀與乙腈的比例分別為87∶13，85∶15，83∶17條件下，測(cè)定腺苷含量。結(jié)果表明，流動(dòng)相比例在87∶13～83∶17之間變化時(shí)，腺苷含量的RSD為0.68%，流動(dòng)相比例的適用性較好。

2.9.4 檢測(cè)波長(zhǎng) 在檢測(cè)波長(zhǎng)分別為255，260，265nm條件下，測(cè)定腺苷含量。結(jié)果表明，檢測(cè)波長(zhǎng)在255 ～ 265nm之間變化時(shí)，腺苷含量的RSD為0.29%，檢測(cè)波長(zhǎng)適用性較好。

2.9.5 色譜柱 在色譜柱分別為T(mén)hermo C18(4.6×250mm，5μm) lot: 14726和12433；Diamonsil C18(4.6×250mm，5μm) 條件下測(cè)定腺苷含量。結(jié)果表明，使用不同型號(hào)的色譜柱，腺苷含量的RSD為1.61%，色譜柱的適用性較好。

2.10 樣品含量測(cè)定 取三批頤神顆粒，測(cè)定腺苷含量。結(jié)果如下。

表2 頤神顆粒樣品腺苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

腺苷存在于頤神顆粒發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉藥材中，是本品種的主要有效成分，為了更有效的控制頤神顆粒的質(zhì)量，保證產(chǎn)品的有效性。本文采用高效液相檢測(cè)法測(cè)定腺苷含量，以磷酸鈉做溶劑，溶解過(guò)濾即得到供試品溶液，試驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒，符合綠色化學(xué)、安全化學(xué)的原則。我們對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，并進(jìn)一步考察了柱溫、流速、流動(dòng)相比例、檢測(cè)波長(zhǎng)及不同色譜柱對(duì)檢測(cè)方法的影響。結(jié)果表明上述影響因素的適用性均良好，方法準(zhǔn)確度高、檢測(cè)限度低，理論板數(shù)均高于4000，是一種簡(jiǎn)單安全、準(zhǔn)確可靠的腺苷含量的檢測(cè)方法。