李俊鵬, 秦美蓉, 冼靜雯, 謝天柱, 金 毅, 陳潤(rùn)樺, 黃澤愉, 陳 寧, 王曉煒, 王 平

(深圳市藥品檢驗(yàn)研究院, 深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東 深圳 518057)

IVC在國(guó)外普遍使用，近年來(lái)國(guó)內(nèi)應(yīng)用也不斷增加，為了考察IVC和開(kāi)放籠兩種飼養(yǎng)方式對(duì)大鼠生長(zhǎng)的影響特進(jìn)行了本試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

4周齡SPF級(jí)SD大鼠, 40只, 雌雄各半, 雌性體質(zhì)量71.9±6.8 g, 雄性體質(zhì)量68.2±6.5 g, 由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(粵)2013-0002],飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，60Co輻照滅菌真空包裝。墊料為玉米芯墊料，由深圳泓騰生物科技有限公司提供，121 ℃ 30 min滅菌處理。飲用滅菌的城市生活用水。按保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范要求動(dòng)物單籠飼養(yǎng)[SYXK(粵)2016-0157]，自由攝食飲水[1]。

1.2 主要儀器與試劑

IVC，BOXUNCP04TCSPT型大鼠飼養(yǎng)籠，籠盒長(zhǎng)×寬×高=36 cm×20 cm×18 cm，意大利TECNIPLAST公司產(chǎn)品。開(kāi)放籠為同型號(hào)籠具加不銹鋼網(wǎng)蓋，不帶密封籠蓋。均每籠一只大鼠。貝克曼Unicel DxC800型全自動(dòng)生化分析系統(tǒng)、血清生化臨床化學(xué)體外診斷試劑由貝克曼實(shí)驗(yàn)有限公司生產(chǎn)。雅培Cell-DYN-3700型五分類(lèi)全自動(dòng)血液分析儀、血液學(xué)臨床化學(xué)體外診斷試劑由雅培制藥有限公司生產(chǎn)。BX4200H-AW電子天平，LEICA DM3000生物顯微鏡，Shandon Excelsior全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)，HM355S全自動(dòng)石蠟切片機(jī)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 大鼠適應(yīng)環(huán)境5 d后, 隨機(jī)分2組,分別為開(kāi)放籠組和IVC組, 每組20只, 雌雄各半。IVC組飼養(yǎng)于正常運(yùn)行的IVC, 設(shè)置為75次換氣/h, 排氣-25%，正壓。開(kāi)放籠組飼養(yǎng)于尺寸和IVC籠具一致的開(kāi)放式大鼠飼養(yǎng)籠[1]。

1.3.2 動(dòng)物飼養(yǎng) 兩組飼養(yǎng)于同一屏障系統(tǒng)，溫度22±1℃，相對(duì)濕度40%～70%。給予同批次的飼料，自由采食和飲水，每周更換墊料和飲水3次，按保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范要求連續(xù)30 d。每周稱1次體質(zhì)量和2次食物攝入量[1]。

1.3.3 動(dòng)物檢測(cè) 30 d后, 大鼠用5 mg/mL戊巴比妥鈉溶液按10 mL/kg 體質(zhì)量腹腔注射麻醉后采血，測(cè)定血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血小板(PLT)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、單核細(xì)胞(MONO)、中性細(xì)胞(NEU)等血液學(xué)指標(biāo), 以及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血糖(GLU)、血清白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TCH)、甘油三脂(TG)等血清生化學(xué)指標(biāo)。剖檢各組大鼠，進(jìn)行大體檢查后，取肝、腎、脾、睪丸(雄鼠)或卵巢(雌性)，稱量絕對(duì)重量，并除以解剖時(shí)空腹體質(zhì)量計(jì)算相對(duì)重量。對(duì)肝、腎、脾、胃腸、睪丸及卵巢進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[1]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS21軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料方差齊時(shí)采用Dunnett檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，采用Tamhane’sT2檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn),P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般活動(dòng)狀況及死亡的影響

在全部試驗(yàn)周期中，各組大鼠一般生理體征、行為、大便小便、皮毛等未見(jiàn)異常。

2.2 開(kāi)放籠組和IVC組之間體質(zhì)量等指標(biāo)比較

開(kāi)放籠組和IVC組雌雄大鼠的體質(zhì)量(表1)、攝食量(表2)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。雌性大鼠IVC組RBC和BUN量低于開(kāi)放籠組 (P＜0.05)(表3、4); 雄性大鼠IVC組RBC、HGB、WBC、BUN、TCH量低于開(kāi)放籠組 (P＜0.05)(表3、4); 開(kāi)放籠組和IVC組雌雄大鼠的臟器重量和系數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表5)。

2.3 大體解剖觀察和組織病理學(xué)檢查

2.3.1 大體解剖觀察 各組大鼠外觀未見(jiàn)明顯異常,無(wú)被毛脫落、皮膚受損等，肛周無(wú)分泌物; 胸腹腔漿膜光滑，未見(jiàn)出血點(diǎn)及積氣積液，主要臟器位置正常，肉眼觀察未見(jiàn)明顯病變。

2.3.2 組織病理學(xué)檢查 對(duì)開(kāi)放籠組和IVC組大鼠的主要臟器作組織病理學(xué)檢查。結(jié)果如下： ①肝臟被膜完整，未見(jiàn)增厚。肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)肝細(xì)胞明顯水樣變性、脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)及膽管內(nèi)未見(jiàn)膽汁淤積。匯管區(qū)無(wú)擴(kuò)張、無(wú)滲出等異常表現(xiàn)。開(kāi)放籠組3例和IVC組2例大鼠的肝臟可見(jiàn)輕度淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)灶(圖1A、B)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。 ②腎臟皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，腎小球未見(jiàn)明顯腫脹或萎縮、變性、壞死等病理改變。腎小管上皮細(xì)胞未見(jiàn)明顯變性、壞死，集合管未見(jiàn)明顯病理改變。開(kāi)放籠組3例和IVC組2例大鼠的腎臟間質(zhì)偶見(jiàn)小灶狀淋巴樣細(xì)胞侵潤(rùn)(圖1C、D)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。③脾臟被膜完整，未見(jiàn)增厚。紅、白髓結(jié)構(gòu)清晰。未見(jiàn)脾小體萎縮、壞死，未見(jiàn)脾竇明顯擴(kuò)張充血等病理改變。④胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的黏膜上皮層完整，未見(jiàn)糜爛、出血、潰瘍等病理改變。腺體排列整齊, 未見(jiàn)萎縮、增生或化生。肌層未見(jiàn)肥厚或萎縮。未見(jiàn)漿膜明顯異常改變。⑤睪丸白膜完整，未見(jiàn)增厚。曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)基底膜增厚、變性等病理改變; 各級(jí)生精細(xì)胞排列有序，未見(jiàn)減少、變性或壞死。未見(jiàn)間質(zhì)水腫、出血。⑥卵巢上皮完整。未見(jiàn)卵巢萎縮、纖維化及腫瘤等病理改變。可見(jiàn)各級(jí)卵泡及黃體。卵泡結(jié)構(gòu)正常, 未見(jiàn)卵泡囊腫、黃體囊腫等改變[2]。綜上所述,開(kāi)放籠組和IVC組大鼠的肝臟、腎臟、脾臟、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸, 睪丸和卵巢的組織病理學(xué)檢查結(jié)果無(wú)明顯差異, 未見(jiàn)明顯病理改變。

表 1 不同飼養(yǎng)方式對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

表 2 不同飼養(yǎng)方式對(duì)大鼠食物攝入量的影響

表 3 不同飼養(yǎng)方式對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

表 4 不同飼養(yǎng)方式對(duì)大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的影響

表 5 不同飼養(yǎng)方式對(duì)大鼠臟器重量和系數(shù)的影響

3 討論

試驗(yàn)期間各組大鼠一般生理體征、行為、大便、小便、皮毛、體質(zhì)量增長(zhǎng)等均未見(jiàn)異常, 所有指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)[3,4], 組織病理學(xué)檢查未見(jiàn)明顯病理改變, 表明IVC和開(kāi)放籠所飼養(yǎng)的動(dòng)物均正常生長(zhǎng), 兩組間生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。IVC組和開(kāi)放籠組比較, IVC組雌性大鼠RBC和BUN量低于開(kāi)放籠組(P＜0.05); IVC組雄性大鼠RBC、HGB、WBC、BUN、TCH量低于開(kāi)放籠組 (P＜0.05)。這可能和IVC的構(gòu)造賦予其對(duì)籠外環(huán)境因素良好的屏蔽作用有關(guān)[5]。嚙齒動(dòng)物膽小敏感，機(jī)體應(yīng)激容易受到外界激發(fā)，IVC這種特性可以減少飼養(yǎng)室環(huán)境內(nèi)各種物理因素對(duì)動(dòng)物的干擾，維持其較低的應(yīng)激本底，這不僅有利于降低環(huán)境應(yīng)激保護(hù)動(dòng)物福利，也為靈敏應(yīng)激反應(yīng)提供了更理想的實(shí)驗(yàn)條件[6]。本試驗(yàn)表明，飼養(yǎng)環(huán)境的不同可能導(dǎo)致動(dòng)物的生理指標(biāo)有所差異，提示同一個(gè)受試物不同組別不能分別在開(kāi)放籠和IVC同時(shí)進(jìn)行飼養(yǎng)。

圖1 IVC組及開(kāi)放組動(dòng)物肝臟及腎臟的炎細(xì)胞浸潤(rùn)組織HE染色觀察