張 薇, 唐 彬, 黎福榮, 趙 勇

(中山大學實驗動物中心, 廣州 510080)

根據(jù)GB14925-2010對飲水的要求，清潔級以上級別實驗動物飲水應達到無菌要求。目前實驗動物屏障設施制作飲用水的途徑主要有： 超濾+臭氧發(fā)生器+紫外線燈、反滲透+臭氧發(fā)生器+紫外線燈和高溫水等，但如何保障屏障設施中的輸水網(wǎng)管、供水末端不滋生細菌，維持消毒殺菌的持續(xù)性是屏障設施飲用水的難點。

微電解技術，又稱為內(nèi)電極法技術。1980年代微電解技術引入我國，主要應用于染料、石油化工、重金屬、醫(yī)藥等廢水的處理。我單位于2008年首次將微電解無菌水機組應用到實驗動物屏障設施飲用水系統(tǒng)的改造，取得了較好的消毒/滅菌效果。繼而在2011～2014年先后將屏障設施的超濾+臭氧+浸沒式紫外線消毒機組改造為超濾+微電解無菌水機組。為了探討其對水、輸水網(wǎng)管的持續(xù)消毒殺菌性能以及對實驗動物健康是否造成影響，本研究對21日齡SD大鼠飲用微電解水與飲用高壓滅菌水后1～8個月的SD大鼠血液生化進行跟蹤檢測，評估長期飲用微電解水是否對SD大鼠的血液生化造成影響。

1 材料與方法

1.1 微電解無菌水系統(tǒng)

由超濾+微電解機殺菌處理。微電解機為10 A、280 W，過濾材料主要有： 石英砂過濾器、5 μm保安濾器、0.1 μm超濾、1 μm精濾; 微電解設備由水處理設備公司提供。

1.2 主要試劑與儀器

Beckman CX-5全自動生化測定儀, 所用試劑、質(zhì)控及標準均為美國Beckman公司產(chǎn)品; 烏來糖，購自國藥集團化學試劑有限公司, 批號： 20150303。

1.3 動物與實驗環(huán)境

21日齡清潔級SD大鼠購自中山大學實驗動物中心[SCXK(粵)2016-0029]。

1.4 實驗方法

1.4.1 無菌水的檢測 檢測方法依據(jù)GB/T1426.41-2001。設6個取水樣的點： 屏障設施內(nèi)用水末端設3個取水點1號、2號、3號; 微電解機房設2個取水點： 輸水管網(wǎng)回水取樣點4號、回水精濾后進入供水網(wǎng)管前為5號，高壓滅菌后的自來水為6號; 在微電解開啟1 h后，以無菌操作方法對上述取水點取樣; 每樣接種2皿營養(yǎng)瓊脂，置35～37 ℃培育箱中48～72 h，觀察皿營養(yǎng)瓊脂皿中的菌落數(shù)，沒有菌落生長，判斷為無菌。

1.4.2 生化指標檢測 21日齡SD大鼠160只，雌雄各半，母鼠在妊娠期及哺乳期均飲高壓滅菌水,21日齡后分2組, 每組80只, 2組分別從21日齡開始飲用超濾+微電解水和高壓滅菌水, 飼養(yǎng)1個月、3個月、5個月、8個月后各取雌雄20只大鼠，各組大鼠禁食12～14 h，用20%烏來糖溶液0.6 mL/100 mg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，用于測定生化指標共 17項： 血糖(GLU)、堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、總膽固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBiL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、磷(P)、鈉(Na)、鉀(K)、氯(Cl)、鈣(Ca)。

1.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，結果用表示，對各項檢測數(shù)據(jù)作單因素方差分析和T檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 水的微生物檢測

在2015年4月9日(2015ZD0166)的檢測中沒有設計4號、5號取樣點，我們在跟蹤觀察中不斷改進，2015年11月19日(2015ZD0610)增設4、5號取樣點，結果5、6號取樣點陽性。其余檢測水樣均未檢測到細菌(表1)。

2.2 大鼠血液生化檢測

21日齡SD大鼠飲用微電解無菌水與高壓滅菌水1～8個月，生化檢測結果比較，飲用微電解組與飲用高壓滅菌水組差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

3 討論

在實驗動物屏障環(huán)境的運行中，水的污染將直接導致屏障設施環(huán)境和動物的污染，最終影響實驗動物質(zhì)量和實驗結果。超濾原理制作無菌水必須在超濾膜額定孔為0.001～0.02 μm時，才能攔截細菌和病毒。反滲透原理制作無菌水，由于反滲透(RO)膜的孔徑達0.0001 μm，細菌、病毒大小是它的5 000倍，因此，只有水分子及部分礦物離子能夠通過。但實驗動物設施飲用水的末端，即飲水口或出水口，需要經(jīng)過較長的輸送管網(wǎng)方能達到。實驗動物飲用水末端有兩種形式： 自動飲水系統(tǒng)，飲水末端就是動物的飲水嘴; 另一種末端位于并暴露在設施內(nèi)潔凈區(qū)。SPF動物，所處設施環(huán)境也未能達到無菌，因此，無論是自動飲水嘴還是暴露于潔凈區(qū)末端出水口，均可發(fā)生病原體逆行侵襲污染的情況。且無菌水從出水口到末端間較長的管網(wǎng)往往容易成為細菌滋生地。

屏障設施內(nèi)動物飲水末端口的暴露和開放，動物飲水系統(tǒng)飲水管嘴與動物口腔食物的接觸，極易造成逆行污染，若沒有有效的持續(xù)殺菌機制，即使是無菌制水系統(tǒng)的初始端獲得無菌水，也難以避免逆行污染。供水管網(wǎng)中的沉淀附著物以及循環(huán)供水管網(wǎng)的死角均有滋生微生物潛在風險。屏障設施無菌水系統(tǒng)的持續(xù)殺菌作用是杜絕逆行污染、供水管網(wǎng)沉淀顆粒和死角等污染的關鍵條件。

目前用于水消毒的方法很多，包括氯氣消毒、臭氧消毒、紫外線消毒等。張德勝等[2]認為，氯氣消毒會產(chǎn)生三鹵甲烷等對人體、動物有害的物質(zhì)。而臭氧消毒、紫外線消毒則存在成本高及沒有持續(xù)殺菌效果等缺點，其實際應用有一定的局限性。趙鵬志[3]報道了微電解在人的直飲水管網(wǎng)消毒殺菌中具有良好的效果，認為臭氧能產(chǎn)生強氧化反應殺菌，但臭氧的強氧化反應, 能將聚丙烯(PP)濾芯及塑料管道、微量元素和礦物質(zhì)氧化，破壞濾材和輸水管網(wǎng)，并產(chǎn)生沉淀或膠體物質(zhì)，影響水質(zhì)或堵塞輸水管網(wǎng); 高濃度臭氧在空氣中超過一定限值可能危及人的生命健康。紫外線消毒具有瞬間殺菌的效果，但沒有持續(xù)殺菌作用，殺菌的強弱與紫外線燈的壽命和質(zhì)量密切相關，隨著使用時間的延長，紫外線逐漸衰減, 殺菌效果明顯下降，需檢測更換。加氯消毒雖然具有一定持續(xù)殺菌能力,但隨時間的推移，氯離子與細菌等有機物的結合殺菌作用也會逐漸消減，而高濃度的漂白粉具有刺激性, 也存在消毒副產(chǎn)物的潛在威脅。李兵等[4-6]報道微電解對大腸桿菌有較好的殺菌作用，且與電流密度、時間具有正相關性。

表 1 2015年～2017年微電解無菌水微生物檢測情況 菌落數(shù)/個

表 2 2組SD大鼠血液生化測定值

續(xù)表2

微電解滅菌的原理： 水分子在陰陽兩級發(fā)生強的氧化還原反應產(chǎn)生活性物質(zhì)， 破壞飲水中細菌的新陳代謝作用，降低其酶活性，使其不能在水中繼續(xù)生存、繁殖，從而達到殺菌目的。微電解使水分子產(chǎn)生活化，活化的水分子對水中的某些有機物質(zhì)產(chǎn)生重要作用，它改變和影響細菌的生理代謝，如基因表達式、酶活性等，最終導致細菌微生物失活直至死亡[7]; 二者協(xié)同作用于水中細菌物質(zhì)最終達到滅菌目的。

本研究采用了10 A，280 W的微電解機組制作屏障繁育設施的無菌水，在2015年11月19日檢測中，5、6號樣品出現(xiàn)污染，5號是回水精濾后進入供水網(wǎng)管前水樣，而回水取樣點、末端采樣點均未檢測到細菌，說明1 μm精濾需立即更換;6號是高壓滅菌水，其污染原因有可能是高壓滅菌器功能下降、培養(yǎng)環(huán)節(jié)污染等; 無論何種原因，采取立即糾正可能存在的原因后，重新檢測1～6號取樣點的水樣，結果沒有出現(xiàn)污染。在對其長達二年多的跟蹤檢測中，微電解出水口、末終端出水口、回水檢測點均未檢測出細菌，表明應用微電解原理制作的無菌水達到了無菌要求，微電解對輸水管網(wǎng)具有持續(xù)殺菌作用，能解決管道沉淀物和死角滋生微生物、終端供水口逆行污染等導致環(huán)境、動物污染的難題，可以保持屏障設施內(nèi)用水的持續(xù)無菌; 微電解過程中，電極在水中放電, 伴隨臭氧生成, 遍布在整個反應器及輸水管網(wǎng), 并持續(xù)存在,可能是微電解具有持續(xù)殺菌作用的原因之一[8]。

轉(zhuǎn)氨酶、血脂類、蛋白類、血肌酐和血尿素氮、鉀鈉氯鈣等分別與肝臟功能、腎功能、電解質(zhì)平衡等密切相關，是動物重要的健康指標，也是動物應用于實驗過程中常用的觀察指標。通過對飲用微電解水、高壓滅菌水后1～8個月SD大鼠的血液生化比較，顯示2組差異沒有統(tǒng)計學意義，表明微電解產(chǎn)生的活性物質(zhì)等對離乳后飲用1～8個月的SD大鼠的血液生化沒有影響; 在屏障設施中使用微電解制水可以保持輸水管網(wǎng)、供水終端以及循環(huán)水的持續(xù)殺菌作用，微電解水可以作為SPF級實驗動物的無菌飲用水。