徐麗瑛, 黎硯書, 鄭國安, 吳金花, 丁 琦, 肖小華

(江西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心, 南昌 330029)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)中醫(yī)歸屬于“脅痛”、“痞滿”、“肝脹”、“肝痞”、“肝癖”、“肝著”、“積聚”、“痰證”、“痰濁”、“濕阻”“瘀證”、“肥氣”、“積證”等范疇[1]。其病機(jī)為脾腎虧虛，脾虛運(yùn)化無力，腎虛氣化不利，而致水濕停聚，進(jìn)而生痰，痰濕內(nèi)蘊(yùn)，繼而生熱化瘀，而致痰、熱、瘀、濁、濕糾結(jié)，繼而傷肝[1]。荷丹片功能為化痰降濁，活血化瘀，由荷葉、丹參、山楂、番瀉葉、補(bǔ)骨脂五味中藥加工而成，臨床用于高脂血癥屬挾痰濁瘀證侯者。由于臨床應(yīng)用顯示其對(duì)脂肪肝患者有降脂作用，因此現(xiàn)將其進(jìn)行二次開發(fā)成一種治療脂肪肝的純中藥復(fù)方制劑。我們選用高糖高脂灌胃給予大鼠制作NAFLD模型，來探討其治療脂肪肝的藥理作用，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量140～170 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2013-0004]。飼養(yǎng)于江西省藥物研究所安全評(píng)價(jià)中心[SYXK(贛)2013-0004]。動(dòng)物飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司[SCXK(京)2014-0010]提供，自由飲食。

1.2 藥品、試劑與儀器

荷丹片，由南昌濟(jì)順制藥有限公司提供，每片重0.73 g，含生藥14.125 g，批號(hào)： 20160601。血脂康膠囊，北京北大維信生物科技有限公司，每粒裝0.3g，批號(hào)： 20160501。非諾貝特片，上海黃海制藥有限責(zé)任公司，規(guī)格，0.1g/片，批號(hào)： 160301。血脂康膠囊，北京北大維信生物科技有限公司，規(guī)格，0.3g/粒，批號(hào)： 20160501。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒，購自中生北控生物科技股份有限公司; 還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)測(cè)試盒，購自南京建成生物工程研究所; 膽固醇(C27H40O)，購自上海精析化工科技有限公司; 膽酸鈉，購自北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠; 1,2-丙二醇，購自上海試劑一廠。

電子天平(MP15KC)，購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司; 半自動(dòng)生化分析儀(BT-224)，購自意大利Biotecnica公司; 石蠟包埋機(jī)(TKD-BMC)，購自孝感泰康達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司; 脫水機(jī)(TP1020)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2126)和攤片機(jī)(HI1210)，均購自上海徠卡儀器有限公司; 顯微鏡(Motic BA300)，購自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 慢性NAFLD模型的建立及分組[2-4]將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成7組, 每組10只, 分別為空白組、模型組、荷丹片低、中、高劑量組、血脂康膠囊組和非諾貝特片組, 再另取同批大鼠5只與模型組大鼠同樣處理。除空白組外, 其余動(dòng)物均灌胃給予高脂乳劑(玉米油400 g、膽固醇100 g、膽酸鈉33 g、丙二醇300 mL)和高糖溶液(奶粉40 g、蔗糖75 g、蒸餾水100 mL), 灌胃容積均為5 mL/kg,每日1次，連續(xù)8周。于造模4周后，取造模大鼠2只解剖，剖取肝臟作病理切片，驗(yàn)證大鼠NAFLD模型是否成功；以大鼠肝臟呈灰黃色，鏡檢見中央靜脈周圍的肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡，判定為NAFLD造模成功。

1.3.2 給藥 模型成功后，各組大鼠均于每日上午仍繼續(xù)灌胃給予高糖高脂乳劑，下午灌胃給藥，灌胃給藥容積均為10 mL/kg，空白組和模型組給予等容積蒸餾水，1次/日，連續(xù)給藥4周。

1.3.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.3.1 大體觀察 試驗(yàn)結(jié)束后處死全部動(dòng)物，肉眼觀察肝臟顏色、質(zhì)地、大小等情況。

1.3.3.2 生化指標(biāo) 末次給藥后禁食12 h，經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈取血, 室溫靜置10 min后, 3 500 r/min離心15 min, 分離血清，按試劑盒說明書操作分別測(cè)大鼠血清ALT、TG、TCH、LDL-C、HDL-C指標(biāo)。脫頸椎處死大鼠, 剖腹取肝臟稱其濕重, 并取肝臟同部位組織精密稱定0.3 g, 剪碎后加入9倍質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉溶液，冰浴中手動(dòng)制勻漿, 2 000 r/min離心10 min, 取上清液測(cè)GSH和MDA含量, 并取肝臟同部位組織精密稱定0.2 g, 剪碎后加入9倍丙酮乙醇(1∶1)溶液中勻漿, 3 500 r/min離心15 min，取上清液測(cè)TG、TCH。

1.3.3.3 組織病理學(xué) 另取肝臟左葉，用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組織形態(tài)學(xué)變化, 拍攝照片。肝損傷病理組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下, 0級(jí)： 正常肝組織，無肝細(xì)胞變性、壞死, 無炎癥細(xì)胞侵潤; I級(jí)： 肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞輕度脂肪變性，偶見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死; Ⅱ級(jí)： 肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞中度脂肪變性，可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，炎癥細(xì)胞侵潤; Ⅲ級(jí)： 肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞重度彌漫性脂肪變性，點(diǎn)狀壞死多見或可見大片肝細(xì)胞壞死。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用DAS 3.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)、臟器系數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，對(duì)組織病理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行Ridit檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模大鼠肝組織觀察

造模4周后，解剖大鼠，見大鼠肝臟略偏大、表面呈灰黃色。鏡檢見中央靜脈周圍的肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡，表明造模成功(圖1A)。

2.2 對(duì)NAFLD大鼠肝組織和血清生化指標(biāo)的影響

造模8周后檢測(cè)生化指標(biāo)，模型組大鼠血清ALT、TG、TCH、LDL含量明顯高于空白對(duì)照組，HDL明顯降低; 荷丹片各劑量組相對(duì)模型組上述指標(biāo)有所改善 (P＜0.05或P＜0.01); 血脂康能顯著降低模型大鼠血清ALT、TG、TCH、LDL; 荷丹片各劑量能明顯改善大鼠ALT、TCH、HDL、LDL指標(biāo)水平, 與非諾貝特組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(表 1)。

與空白對(duì)照組比較, 模型組大鼠肝組織MDA、TCH、TG含量升高、GSH含量降低(P＜0.01); 與模型組比較，荷丹片能顯著降低模型大鼠肝組織MDA、TCH和TG。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與非諾貝特組比較，荷丹片能明顯改善大鼠GSH指標(biāo)水平 (P＜0.05)，詳見表2。

表 1 荷丹片對(duì)NAFLD大鼠血液生化指標(biāo)的影響

表 2 荷丹片對(duì)NAFLD大鼠肝組織生化指標(biāo)的影響

2.3 對(duì)肝系數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠肝系數(shù)增大(P＜0.01); 與模型組比較, 荷丹片對(duì)NAFLD大鼠肝系數(shù)無影響, 非諾貝特組大鼠肝系數(shù)增大明顯 (P＜0.01),詳見表3。

表 3 荷丹片對(duì)NAFLD大鼠肝系數(shù)的影響

2.4 對(duì)NAFLD大鼠肝組織病理學(xué)的影響

病理組織學(xué)檢查, 空白組肝組織結(jié)構(gòu)正常, 肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞索排列整齊，肝血竇正常, 核圓，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)均勻(圖1B); 模型組中央靜脈周圍的肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡，肝小葉界限模糊, 小葉內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)點(diǎn)狀或大片狀壞死，匯管區(qū)見大量炎癥細(xì)胞侵潤(圖1C)。荷丹片7.06 g/kg和14.12 g/kg組肝細(xì)胞腫脹不明顯, 脂肪變性及炎癥細(xì)胞侵潤均較模型對(duì)照組顯著減輕, 無大片狀壞死(圖1G、H)。荷丹片3.53 g/kg組時(shí)肝細(xì)胞腫脹較模型組減輕, 脂肪變性、炎癥細(xì)胞侵潤及壞死程度改變不明顯(圖1F)。血脂康0.1 g/kg組肝細(xì)胞腫脹，脂肪變性、炎癥細(xì)胞侵潤及壞死程度均顯著降低(圖1E)。非諾貝特0.05 g/kg組大鼠肝組織中央靜脈周圍的肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡，肝小葉界限模糊, 小葉內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)點(diǎn)狀及大片狀壞死，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞侵潤(圖1D)。肝損傷病理組織學(xué)分級(jí)結(jié)果見表4。

3 討論

NAFLD是一種無過量飲酒史, 但病理學(xué)改變類似酒精性脂肪性肝病，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征[2]，包括單純性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝硬化[5,6]。同時(shí)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為脂肪肝是肝臟脂蛋白代謝紊亂，甘油三酯的合成速度大于將其泌入血液的速度, TG大量堆積于肝臟而致的一種病理改變[7]。NAFLD目前尚無特效治療藥物，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要是通過改善胰島素抵抗，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境脂質(zhì)代謝、能量代謝和抗氧化物的平衡，促使機(jī)體保持在適應(yīng)性反應(yīng)階段，延緩、阻止脂肪性肝病的病情進(jìn)展。針對(duì)個(gè)體病情，可適當(dāng)采取控制體質(zhì)量的方式輔助治療，終末期肝病需采取肝移植手術(shù)治療。

圖1 荷丹片對(duì)NAFLD模型大鼠肝組織病理學(xué)影響(HE×100)

表 4 荷丹片對(duì)大鼠NAFLD組織病理學(xué)的影響

我們采用含高糖高脂組成的乳液給動(dòng)物灌胃復(fù)制的模型具有人類非酒精性脂肪性肝病的重要特征。模型組血脂、肝脂均比空白組顯著增加, 鏡檢顯示肝細(xì)胞腫脹, 出現(xiàn)脂肪空泡, 肝小葉內(nèi)出現(xiàn)大片狀壞死, 匯管區(qū)見大量炎癥細(xì)胞浸潤, 表明模型成功。

非諾貝特0.05 g/kg劑量能顯著降低脂肪肝模型大鼠血清TG和肝組織TG，顯著增加肝組織GSH;非諾貝特0.05 g/kg增加血清TCH、LDL，降低血清HDL。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，非諾貝特對(duì)肝臟有損傷作用，血清ALT、AST均升高[8]; 與試驗(yàn)結(jié)果一致。非諾貝特0.05 g/kg劑量顯著增加大鼠肝系數(shù)，由于該組大鼠體質(zhì)量顯著降低，且非諾貝特對(duì)肝臟造成損傷，肝臟重量增加等原因所致。由于非諾貝特本身對(duì)肝臟具有損傷作用，會(huì)加重大鼠脂肪肝模型動(dòng)物肝臟的損傷，解剖可見其肝臟明顯腫大，且呈灰黃色，可能引起其脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致其血液中TCH和LDL增加、HDL下降。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，荷丹片對(duì)NAFLD模型大鼠血清生化指標(biāo)的改變具有明顯改善作用，可降低血脂和肝脂，改善肝病理組織學(xué)改變，與陽性對(duì)照藥非諾貝特比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其劑量組間無明顯差異，無劑量相關(guān)性，其作用機(jī)制可能為通過抗氧化作用，抗肝細(xì)胞壞死和抑制脂質(zhì)吸收，減少TG合成等因素有關(guān)。