蔡克瑞 劉志新 孫曉冬 閆 磊

(牡丹江醫(yī)學(xué)院組胚教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

肉蓯蓉為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，含多種活性成分，多糖是其主要活性成分之一。肉蓯蓉及其有效成分具有抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理作用，但有關(guān)肉蓯蓉多糖對(duì)衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬探討肉蓯蓉多糖對(duì)衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 昆明種小鼠60只，雌雄各半(牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。D-半乳糖(上海試劑二廠)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細(xì)胞凋亡、Bcl-2、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物制品有限公司)；TritonX-100、二甲基亞砜、胰蛋白酶(華舜生物工程有限公司)；Scout-Ⅱ半自動(dòng)生化分析儀；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；真空泵，恒壓穩(wěn)流電泳儀，生化培養(yǎng)箱，OLYMPUS熒光顯微鏡。

1.2方法

1.2.1肉蓯蓉多糖的制備 肉蓯蓉生藥片，經(jīng)熱乙醇浸泡3 h后，紗布過(guò)濾后棄濾液。藥渣加水煎煮3次，每次1～2 h，過(guò)濾后合并濾液。蒸發(fā)濃縮后離心去沉淀，上清液加2～3倍體積的95%乙醇沉淀，4℃靜置24 h，次日4℃ 6 000 r/min離心20 min收集沉淀。沉淀經(jīng)水復(fù)溶、脫蛋白透析、冷凍干燥后獲粗多糖。

1.2.2D-半乳糖致衰小鼠模型的建立 60只昆明種小鼠隨機(jī)分為青年對(duì)照組，衰老模型組，肉蓯蓉多糖組，每組20只。衰老模型組和肉蓯蓉多糖組每日上午頸背部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg，連續(xù)30 d。青年對(duì)照組每日頸背部皮下注射相同劑量的生理鹽水。每天皮下注射的同時(shí)灌胃給藥，肉蓯蓉多糖組灌服肉蓯蓉多糖(折合生藥0.01 g/ml)，青年對(duì)照組和衰老模型組每日灌胃相同劑量的蒸餾水，連續(xù)30 d。

1.2.3動(dòng)物處理及指標(biāo)測(cè)定 30 d后所有小鼠斷頭處死，立即取出腦組織，取大腦中部中性甲醛固定。余下腦組織一部分用生理鹽水制成勻漿，一部分用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液。

取腦組織勻漿，按SOD、MDA、GSH-Px試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用半自動(dòng)生化分析儀比色分析測(cè)定結(jié)果。DNA的損傷率采用單細(xì)胞凝膠電泳法即彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)；免疫組化法檢測(cè)Bcl-2基因表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS16.0軟件行q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肉蓯蓉多糖對(duì)小鼠腦SOD、MDA、GSH-Px、DNA損傷率和細(xì)胞凋亡的影響 灌服肉蓯蓉多糖可提高致衰小鼠SOD活性、GSH-Px活力，降低MDA含量，增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)能力，減少凋亡細(xì)胞數(shù)。見(jiàn)表1，圖1～3。

表1 肉蓯蓉多糖對(duì)D-半乳糖致衰小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的影響

與青年對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與衰老模型組比較：3)P<0.01

圖1 小鼠腦組織HE染色(×100)

圖2 衰老模型組腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡(×400)

圖3 肉蓯蓉多糖組腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡(×400)

2.2肉蓯蓉多糖對(duì)腦組織Bcl-2表達(dá)強(qiáng)度的影響 青年對(duì)照組腦組織Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)18例，衰老模型組為4例，肉蓯蓉多糖組為16例，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。肉蓯蓉多糖可增強(qiáng)D-半乳糖致衰小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)強(qiáng)度。見(jiàn)圖4。

圖4 衰老模型組和肉蓯蓉多糖組腦組織Bcl-2表達(dá)(免疫組化法)

3 討 論

衰老自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為人類(lèi)隨年齡增長(zhǎng)的退行性變化是由自由基活性氧化損傷作用所致。D-半乳糖致亞急性中毒狀態(tài)下，體內(nèi)產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基，對(duì)組織產(chǎn)生過(guò)氧化損害，這種生化和組織結(jié)構(gòu)的改變與自然衰老表現(xiàn)基本吻合。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞程序性死亡對(duì)衰老起主動(dòng)作用，并引起特征性形態(tài)改變及衰老性生長(zhǎng)停滯，衰老細(xì)胞死亡的實(shí)質(zhì)就是細(xì)胞凋亡〔1〕。Bcl-2家族蛋白在調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡和生存中發(fā)揮重要作用，家族成員包括促凋亡基因和抑制凋亡基因，抑制細(xì)胞凋亡的基因主要有Bcl-2、Bcl-xl等。Bcl-2基因是一種原癌基因，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用〔2，3〕。Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可減少神經(jīng)元程序性細(xì)胞死亡，引起特定腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目增多。

肉蓯蓉又名金筍、地精，為列當(dāng)科植物肉蓯蓉或管花肉蓯蓉的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、青海等地；性溫、味甘咸，為補(bǔ)腎壯陽(yáng)、潤(rùn)腸通便之要藥，有“沙漠人參”的美譽(yù)，《中國(guó)藥典》2010年版收錄的肉蓯蓉和管花肉蓯蓉為正品藥材〔4，5〕?，F(xiàn)代藥理研究也證明肉蓯蓉除具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、潤(rùn)腸通便作用外，還具有抗疲勞、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及增強(qiáng)記憶力等作用。吳波等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉總苷能明顯提高亞急性衰老小鼠抗氧化及延緩衰老的作用；尹剛等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉多糖通過(guò)調(diào)控抗凋亡基因表達(dá)水平抑制大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示灌服肉蓯蓉多糖后，衰老小鼠各項(xiàng)衰老指標(biāo)得以改善，其原因與以下因素有關(guān)：①肉蓯蓉多糖作為一種功效顯著的天然抗氧化劑，可清除超氧自由基、羥自由基、單線態(tài)氧等多種自由基及其代謝產(chǎn)物，使SOD的消耗減少、活性上升，MDA含量下降。②肉蓯蓉多糖中含有多種人體必需的微量元素，能提高DNA損傷的修復(fù)能力。③肉蓯蓉多糖有促進(jìn)代謝、調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)水平，通過(guò)Bcl-2發(fā)揮其抗氧化作用，可減少氧自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成，減少體內(nèi)自由基積聚引起的一系列連鎖反應(yīng)，減少DNA氧化損傷，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

綜上，肉蓯蓉多糖具有改善衰老小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用，這種作用與其抗氧化、抗凋亡及上調(diào)Bcl-2表達(dá)水平有關(guān)，但Bcl-2表達(dá)與激活途徑的具體機(jī)制及與抗氧化、抗凋亡之間的關(guān)系還不清楚，將在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中深入研究。