方浩威 肖圣華

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬厚街醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 東莞 523945)

腦缺血是一種常見的腦血管疾病，其發(fā)病率約占腦血管疾病的75%。大部分的腦缺血是由血栓引起的，因此溶栓治療是最為有效的治療方法，但是溶栓治療的治療時(shí)間窗很窄，只有少數(shù)患者能夠在發(fā)病早期可以接受溶栓治療，使得缺血區(qū)域的血流供應(yīng)得到恢復(fù)，但是隨著血流供應(yīng)的恢復(fù)，伴隨而來的再灌注損傷仍然影響患者治療效果〔1,2〕。因此，在臨床上迫切需要能夠減輕缺血或細(xì)胞損傷，延遲或組織神經(jīng)元死亡，延長缺血耐受時(shí)間和治療時(shí)間窗用于治療或減少缺血再灌注損傷治療〔3〕。左卡尼汀又名左旋肉堿，是存在于機(jī)體中一種特殊的氨基酸，能夠促進(jìn)長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化的關(guān)鍵物質(zhì)。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，左卡尼汀可以促進(jìn)能量代謝，保護(hù)線粒體，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度從而起到清除自由基和抗凋亡等作用。目前左卡尼汀廣泛用于肝臟疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭等疾病〔4,5〕。近年來，左卡尼汀發(fā)現(xiàn)可以用于治療缺血再灌注損傷，受到廣泛關(guān)注。本研究在老年大鼠缺血再灌注損傷模型中研究左卡尼汀對其作用，旨在尋找左卡尼汀的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠，20～22周齡，均為SPF級，均為雄性，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，使用許可證號為syxk(浙)2014-0008。大鼠飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物房中，動(dòng)物房溫度維持在20～25℃，相對濕度為30%～60%，自由禁食禁水。12 h照明12 h避光，正式試驗(yàn)前適應(yīng)新飼養(yǎng)至少1 w。

1.2試劑和儀器 左卡尼汀購自珠億邦制藥有限公司；三磷酸腺苷(ATP)酶試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)開發(fā)公司。使用TICAN公司生產(chǎn)的E2000型酶標(biāo)儀。

1.3方法 將36只大鼠根據(jù)體重均衡隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和左卡尼汀組。大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，剃毛消毒，于頸部中間部位做2 cm切口，鈍性分離肌肉暴露右頸動(dòng)脈，仔細(xì)分離血管和神經(jīng)，游離出頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸動(dòng)脈近心端，壓閉頸內(nèi)動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈下支剪出一切口后置入直徑為0.23 mm的PVC軟管，組閉2 h后抽出軟管，恢復(fù)再灌流。假手術(shù)組分離頸內(nèi)外動(dòng)脈，但不置入軟管，其余與模型組一致。左卡尼汀組在進(jìn)行模型手術(shù)前30 min腹腔注射200 mg/kg左卡尼汀。

1.4觀察指標(biāo) 三組動(dòng)物在恢復(fù)再灌注后24 h麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心后去血清備用。迅速摘取大鼠腦部，并置于液氮中備用。測定血清和腦組織中ATP、MDA和SOD的含量；并通過ELISA試劑盒測定腦組織中NO、NOS、cGMP和TNF-α的水平。神經(jīng)損傷的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：無神經(jīng)功能損傷為0分；大鼠提起尾部不能伸展左側(cè)前爪為1分；動(dòng)物行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為中毒神經(jīng)功能缺損極為2分；大鼠行走困難或向左側(cè)傾倒為3分；大鼠不能行走為4分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1左卡尼汀對神經(jīng)功能評分的影響 模型組恢復(fù)再灌注24 h后，神經(jīng)損傷評分為(2.73±0.85)分，顯著高于左卡尼汀組〔(1.52±0.63)分，P<0.05〕。

2.2左卡尼汀對大鼠缺血再灌注損傷后血清炎癥指標(biāo)的影響 模型組大鼠血清SOD、IL-6、MDA與假手術(shù)組相比有顯著差異(P<0.05)；而TNF-α的水平與假手術(shù)組相比無顯著差異(P>0.05)；左卡尼汀組與模型組相比，SOD和IL-6含量顯著高于模型組；MDA含量顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

2.3左卡尼汀對缺血再灌注損傷后大鼠腦組織炎癥因子的影響 模型組腦組織MDA和TNF-α顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；左卡尼汀組與模型組相比，顯著降低腦組織中MDA和TNF-α的水平。與假手術(shù)組相比，模型組顯著降低了SOD和IL-6的水平，而左卡尼汀處理后顯著提高了SOD和IL-6的水平(P<0.05)。見表2。

2.4左卡尼汀對缺血再灌注損傷后大鼠腦組織ATP酶、NO、NOS和cGMP含量的影響 模型組NO、NOS和cGMP含量顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，左卡尼汀組與模型組相比可以顯著降低NO、NOS和cGMP的含量(P<0.05)。ATP酶結(jié)果表明，模型組腦組織中ATP酶的活力顯著低于假手術(shù)組，而左卡尼汀組腦組織中ATP酶的活力顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，見表3。

表1 左卡尼汀對大鼠缺血再灌注損傷后血清炎癥因子的影響

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2 左卡尼汀對缺血再灌注損傷后大鼠腦組織炎癥因子的影響

表3 左卡尼汀對缺血再灌注損傷后大鼠腦組織ATP酶、NO、NOS和cGMP含量的影響

3 討 論

正常的血液循環(huán)是維持機(jī)體組織、細(xì)胞保持正常生理功能的基本條件。各種原因所致的組織血液灌流量不足會導(dǎo)致組織局部缺血，導(dǎo)致局部組織能量代謝障礙、活性氧增多，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)發(fā)生，最后炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致組織損傷〔6〕。如何有效預(yù)防并積極治療組織的缺血再灌注損傷是目前臨床上急需解決的治療難題。目前，臨床上主流的治療方法是對缺血組織預(yù)處理及在缺血發(fā)生前采取相應(yīng)措施，提高靶區(qū)域細(xì)胞對缺血和缺氧的耐受程度，并且在缺血后處理及采取短暫的再灌注-缺血交替處理方法，但是不僅操作繁瑣，而且往往難以診斷患者是否存在局部缺血風(fēng)險(xiǎn)，難以真正有效實(shí)施。最近的研究表明，在缺血-再灌注損傷中，由于線粒體的損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡可能損傷中的關(guān)鍵部位。

因?yàn)槟X缺血再灌注患者的病情緊急，對患者的危害極大，臨床治療的方式因患者個(gè)體差異而存在較大的差異，較難采用臨床病例進(jìn)行腦缺血再灌注相關(guān)研究。關(guān)于腦缺血再灌注損傷的相關(guān)研究多采用動(dòng)物模型進(jìn)行試驗(yàn)研究，臨床造模腦缺血再灌注的方法較多，以大鼠應(yīng)用最多。常用的大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀?動(dòng)脈線栓模型〔7〕三血管阻斷(阻斷基底動(dòng)脈和雙側(cè)頸總動(dòng)脈)模型〔8〕、四血管阻斷(夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈并阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈)模型〔9〕、夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈模型、結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈模型〔10〕、夾閉沙土鼠頸總動(dòng)脈模型〔11〕、動(dòng)脈引流模型〔12〕等。本文采用較為常用的結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈模型造模。左卡尼汀是脂肪酸代謝過程中必需的氨基酸，能夠促進(jìn)長鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體中從而發(fā)生β氧化，同時(shí)具有保護(hù)線粒體mtDNA缺失，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用〔13，14〕。因此，左卡尼汀在治療缺血再灌注損傷上的作用是目前關(guān)注的重點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，左卡尼汀能夠降低由于缺血再灌注損傷所引起的血清MDA水平的上升。MDA一般被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的標(biāo)志，左卡尼汀可以顯著降低腦缺血-再灌注損傷大鼠血清MDA水平，可能是其改善大鼠腦缺血再灌注損傷的原因之一。本研究結(jié)果表明，左卡尼汀能夠顯著降低腦組織中MDA的含量，并顯著提高SOD水平，表明左卡尼汀具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的作用。進(jìn)一步的研究表明，左卡尼汀能夠顯著降低腦組織中NO、cGMP和NOS水平。NO是哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的一種強(qiáng)生物活性物質(zhì)，由NOS催化生成，NO在體內(nèi)有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其主要是通過下游cGMP產(chǎn)生作用，提示左卡尼汀能夠降低NOS、NO和cGMP的含量顯著降低缺血再灌注損傷引起的一系列生物學(xué)反應(yīng)〔15，16〕。而且左卡尼汀可能會通過提高腦組織ATP酶的活力，從而降低腦組織細(xì)胞中線粒體損傷，減輕大鼠缺血再灌注損傷。

綜上所述，左卡尼汀能夠顯著改善大鼠缺血再灌注損傷模型導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，其作用機(jī)制可能是通過降低血清和腦部MDA水平，降低腦部組織中NO、NOS和cGMP水平，提高SOD和ATP酶的活力相關(guān)。