袁彩君+++朱天新

[摘要] 目的 建立一種以陰離子色譜柱為分離介質(zhì)測定左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)A的高效液相色譜法。 方法 色譜柱為PhenoSphere 5u SAX 80A（250 mm×4.60 mm），柱溫30℃；流動相為乙腈∶磷酸鹽溶液（磷酸二氫鉀6.81 g/L，以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為4.7）=65∶35；檢測波長為205 nm，進樣量20 μl；流速1.0 ml/min，外標(biāo)法計算。 結(jié)果 左卡尼汀和雜質(zhì)A得到有效分離，分離度>1.5，輔料及流動相不干擾測定；左卡尼汀的檢出限和定量限分別為0.5、2 μg/ml，左卡尼汀雜質(zhì)A的檢出限、定量限分別為20、50 ng/ml；左卡尼汀在1034～8274 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2=0.99996），雜質(zhì)A在0.25～25 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2=0.99987）；左卡尼汀和雜質(zhì)A平均回收率分別為101.29%（RSD=0.55%）、100.35%（RSD=1.79%）。 結(jié)論 該方法專屬、準(zhǔn)確、簡便，可用于左卡尼汀注射液的含量和雜質(zhì)A測定。

[關(guān)鍵詞] 左卡尼汀注射液；左卡尼??；雜質(zhì)A；高效液相色譜法；測定

[中圖分類號] R927.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）07（a）-0008-06

Content and impurity A of levocarnitine injection determined by high performance liquid chromatography

YUAN Cai-jun1 ZHU Tian-xin2

1.Department of Pharmacy，Zhumadian Central Hospital in Henan Province，Zhumadian 463000，China；2.Xintai Pharmaceutical Co.， LTD. of Henan Province，Zhumadian 463000，China

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method determining the content and impurity A of levocarnitine injection selecting anion chromatographic column as separation medium. Methods The column was PhenoSphere 5u SAX 80A （250×4.60 mm） and the column temperature was 30 ℃.The mobile phase was the ratio of acetonitrile and phosphate solution （potassium dihydrogen phosphate of 6.81 g/L regulated by sodium hydroxide solution with the pH of 4.7） was 65：35.The detection wavelength was 205 nm and injection volume was 20 μl.The flow velocity was 1.0 ml/min and the outcome were calculated by external standard method. Results Levocarnitine and impurity A was effectively separated，and the degree of separation was over 1.5.Determination was not interfered by adjuvant material or mobile phase.The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） of levocarnitine was 0.5 μg/ml and 2 μg/ml respectively.The LOD and LOQ of impurity A in levocarnitine was 20 ng/ml and 50 ng/ml respectively.Ranging from 1034 to 8274 μg/ml，levocarnitine displayed a good linear relationship （r2=0.99996）.Ranging from 0.25 to 25 μg/ml，impurity A displayed a good linear relationship （r2=0.99987）.The average recovery rate of levocarnitine and impurity A was 101.29% （RSD=0.55%） and 100.35% （RSD=1.79%）. Conclusion The established method is specific，accurate and convenient，which can be used for the determination of content and impurity A in levocarnitine injection.

[Key words] Levocarnitine injection；Levocarnitine；Impurity A；High performance liquid chromatography；Determination

左卡尼汀（levocarnitine，LC）又稱左旋肉毒堿，其主要功能是將長鏈脂肪酸運至線粒體進行β-氧化，并產(chǎn)生能量；它還能加速乙酰乙酸的氧化，在酮體代謝中起到積極作用。LC參與異亮氨酸和亮氨酸等代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運，有益于氨基酸的正常代謝，并參與精子的成熟過程；其對脂溶性維生素A、E和D及鈣、磷的吸收還有協(xié)同作用[1]。

LC注射液首先由意大利Sigma-Tau 公司研制生產(chǎn)，并于1999 年12月通過FDA批準(zhǔn)上市，用于尿毒癥、心血管疾病如心絞痛[2-3]、心肌梗死[4]、心力衰竭等[5]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[6]、腎病[7-9]、肝病[10-11]、糖尿病[12]等疾病的治療，臨床應(yīng)用越來越廣泛。LC與LC制劑的測定方法較多，有酶法[13]、放射性同位素法[14]、光學(xué)法[15]、滴定法[16]、柱前衍生化HPLC法[17-19]、反相色譜法[20-22]等，其中酶法、同位素法、光學(xué)法、滴定法精密度、重復(fù)性較差；柱前衍生化HPLC法主要用于血藥、尿液濃度監(jiān)測[17-18]或異構(gòu)體測定[19]，尚無檢測雜質(zhì)A的報道。國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[22]收載的方法不能很好地將LC和其雜質(zhì)A分開、歐盟藥典[23]所選用的色譜柱為丙胺基甲基硅烷鍵合硅膠柱（aminopropylm ethylsilyl silicagel），在國內(nèi)尚未找到相應(yīng)的色譜柱，且該標(biāo)準(zhǔn)對LC與其雜質(zhì)A的分離度限度要求（≥0.9）較低。本試驗建立了以陰離子交換柱為分析介質(zhì)的LC注射液高效液相色譜法（HPLC），可用于該注射液的含量測定及雜質(zhì)A控制。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津LC-10A二元泵），電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），水為注射用水，乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉均為分析純；左卡尼汀注射液，河南欣泰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：1 g∶5 ml，批號20100801、20100802、20100803；左卡尼汀注射液，意大利Sigma-Tau生產(chǎn)，規(guī)格：1g∶5 ml，批號080480；LC對照品（美國藥典會，批號CAT. No.1359903），LC雜質(zhì)A對照品：美國藥典會，批號CAT. No.1359925。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：PhenoSphere 5u SAX 80A（250 mm×4.60 mm）檢測波長：205 nm，柱溫：30℃。流動相：乙腈∶磷酸鹽（磷酸二氫鉀6.81 g/L，以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為4.7）=65∶35。流速為1.0 ml/min，進樣量為20 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 LC對照品溶液 精密稱取適量LC對照品，置25 ml 容量瓶中，加流動相溶解并稀釋成約5 mg/ml 溶液，振搖、混勻備用。

2.2.2 參比溶液a 精密稱取LC雜質(zhì)A對照品適量用水溶解并稀釋成每毫升含0.25 mg的溶液，再精密量取1.0 ml用流動相稀釋至10.0 ml，使成25 μg/ml的溶液（雜質(zhì)A濃度為LC對照品溶液濃度的0.5%），振搖、混勻備用。

2.2.3 參比溶液b 精密稱取LC雜質(zhì)A對照品適量用水溶解并稀釋成每毫升含1.0 mg的溶液，再精密量取1.0 ml用流動相稀釋至10.0 ml，使成100 μg/ml的溶液，振搖、混勻備用。

2.2.4 參比溶液c 精密稱取LC對照品適量，用參比溶液b溶解并稀釋成每毫升約含LC對照品10 mg的溶液，振搖、混勻備用。

2.2.5 供試品溶液 精密量取取LC注射液1.25 ml，用流動相稀釋至50 ml，振搖、混勻備用。

2.3 專屬性

2.3.1 破壞性試驗 ①未破壞：取LC約0.1 g，置于10 ml容量瓶中，用2 ml注射用水溶解，再加入流動相至刻度，搖勻，作為供試品溶液；②酸破壞：取LC約0.1 g，置于10 ml容量瓶中，用0.5 mol/L鹽酸溶液2 ml溶解，1 h后用1 mol/L氫氧化鈉中和，再加入流動相至刻度，搖勻，作為供試品溶液；③堿破壞：取LC約0.1 g，置于10 ml容量瓶中，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml溶解，1 h后用1 mol/L鹽酸中和，再加入流動相至刻度，搖勻，作為供試品溶液；④氧破壞：另取LC約0.1 g，置于10 ml容量瓶中，用過氧化氫溶液（3滴加水至25 ml）2 ml溶解，1 h后用加入流動相至刻度，搖勻，作為供試品溶液；⑤高溫破壞：取LC原料約0.5 g，用注射用水10 ml溶解，于100℃水浴2 h，取2 ml置于10 ml容量瓶中，加入流動相至刻度，振搖混勻，作為供試品溶液；⑥光破壞：取LC原料約0.5 g，用注射用水10 ml溶解，強光照射4 h，取2 ml置于10 ml容量瓶中，加入流動相至刻度，振搖混勻，作為供試品溶液。

分別用選定的色譜條件進行試驗，結(jié)果表明在該色譜條件下LC降解產(chǎn)生的各雜質(zhì)峰與主成分峰能很好分離，分離度均>1.5，各破壞性試驗樣品色譜圖見圖1。

2.3.2 干擾試驗 按處方取輔料，依供試品溶液制備法制備空白輔料溶液，分別取空白輔料溶液、空白流動相、LC對照品溶液、參比溶液c 20 μl，按2.1項下的色譜條件進行試驗，結(jié)果見圖2，輔料及流動相在LC對照品和雜質(zhì)A對照品的保留時間處無干擾；LC與最近的雜質(zhì)峰（雜質(zhì)A）的分離度為1.895，LC的理論塔板數(shù)為1369，雜質(zhì)A的理論板數(shù)為2417。

2.4 LC和LC雜質(zhì)A的檢出限和定量限

精密量取LC對照品溶液，逐步稀釋配制系列濃度的溶液，分別進樣測定，以信噪比（S/N）≥3 計算檢出限，S/N≥10計算定量限；另將參比溶液a用流動相稀釋成不同濃度溶液，同法測定檢出限和定量限。結(jié)果LC的檢出限和定量限分別為0.5、2.0 μg/ml，LC雜質(zhì)A的檢出限和定量限分別為20、50 ng/ml，色譜圖見圖3。

2.5 線性關(guān)系考察

2.5.1 LC線性關(guān)系考察 精密稱取LC對照品適量，加流動相溶解并稀釋至10 mg/ml，精密吸取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0 ml 置10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別吸取20 μl 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，將峰面積（y）對應(yīng)LC濃度（x）進行回歸，得方程：y=876.635 1091x+39 115.3624，r2=0.999 96（n=7）。LC進樣濃度在1034～8274 μg/ml 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 雜質(zhì)A線性關(guān)系考察 取LC雜質(zhì)A對照品適量，加流動相溶解并稀釋至25 μg/ml，精密吸取上述溶液0.1、1.0、2.0、5.0、10.0 ml置10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別吸取20 μl 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)， 將峰面積（y）對應(yīng)雜質(zhì)A濃度（x）進行回歸，得方程：y=70 089.711 57x-7196.889 747，r2=0.999 87（n=5）。雜質(zhì)A進樣濃度在0.25～25 μg/ml 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗

精密稱取LC對照品適量，加流動相溶解并稀釋至5 mg/ml，搖勻備用。吸取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進樣6次，記錄LC和雜質(zhì)A對應(yīng)峰的峰面積，分別計算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果LC對應(yīng)峰和雜質(zhì)A對應(yīng)峰峰面積平均值的RSD分別為0.38%、1.62%（n=6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取2.6項下制作的溶液，分別在0、2、4、6、8 h測定，結(jié)果5次測定值基本不變，LC對應(yīng)峰和雜質(zhì)A對應(yīng)峰峰面積平均值的RSD分別為0.093%、1.01%（n=5），顯示樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密量取同一樣品共6 份，分別加流動相溶解并稀釋至5.0 mg/ml，測定含量，結(jié)果LC對應(yīng)峰和雜質(zhì)A對應(yīng)峰峰面積平均值的RSD分別為0. 32%、1.83%，說明重復(fù)性良好。

2.9 LC加樣回收率試驗

依法配制LC 4.0、5.0、6.0 mg/ml 低、中、高3 種濃度溶液各3 份，每份分別按每支的處方量加入輔料，混勻，濾過，依法測定，LC平均回收率為101.29（n=9），RSD為0.55%，結(jié)果見表1，表明輔料對測定無干擾，回收完全。

2.10 LC雜質(zhì)A加樣回收率試驗

依法配制LC雜質(zhì)A 12.5、25.0、37.5 μg/ml 低、中、高3 種濃度溶液各3 份，每份分別按每支的處方量加入輔料，混勻，濾過，依法測定，雜質(zhì)A平均回收率為100.35（n=9），RSD 為1.79 %，結(jié)果見表2，表明輔料對測定無干擾，回收完全。

2.11 樣品含量測定

精密吸取LC注射液三個批次樣品各1 ml，加流動相制成每毫升含5 mg 的溶液作為供試品溶液，取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取2.2項下的LC對照品溶液和參比溶液a，同法測定，按外標(biāo)法計算LC和雜質(zhì)A的量，結(jié)果見表3。

3 討論

在主藥強酸、強堿破壞試驗及強光光照試驗以及高溫試驗過程中發(fā)現(xiàn)，在本實驗HPLC色譜條件下，在相對于主峰保留時間1.20處能檢出有關(guān)物質(zhì)，經(jīng)與LC雜質(zhì)A對照品對比可知本雜質(zhì)即為雜質(zhì)A。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，歐洲藥典[23]、美國藥典[24]均對LC雜質(zhì)A的限度做出規(guī)定，現(xiàn)有LC注射液國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[22]只對總雜質(zhì)限度做出規(guī)定（自身對照法，<2%），未對已知雜質(zhì)A的限度做出明確規(guī)定。文獻[20]和本文2.3.2項數(shù)據(jù)均顯示LC雜質(zhì)A的響應(yīng)值遠大于LC，采用自身對照法單純控制總雜質(zhì)限度難以有效控制LC制劑的質(zhì)量。此外，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[16，22]規(guī)定的LC有關(guān)物質(zhì)測定方法不能將LC和雜質(zhì)A有效分開，我們曾嘗試用C18柱來分析LC及雜質(zhì)A，但兩者分離度很小，改變流動相配比也難以將兩者的分離度提高到0.9 以上而放棄。

根據(jù)LC在水溶液中顯弱酸或弱堿性，在水溶液中分子帶有一定電荷的特點，參考EP 6.0[23]收載的LC標(biāo)準(zhǔn)，我們選擇強陰離子交換柱PhenoSphere 5u SAX 80A為分析介質(zhì)，在流動相為乙腈∶磷酸鹽（磷酸二氫鉀6.81 g/L，以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為4.7）=65∶35、流速1.0 ml/min的色譜條件下，LC和降解產(chǎn)生的各雜質(zhì)峰得到有效分離，LC和最近雜質(zhì)峰（雜質(zhì)A）的分離度>1.5，輔料及流動相不干擾LC及雜質(zhì)A的測定。

在該色譜條件下，LC的檢出限和定量限分別為0.5、2.0 μg/ml，LC雜質(zhì)A的檢出限、定量限分別為20、50 ng/ml；LC在1034～8274 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，雜質(zhì)A在0.25～25 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 。

試驗結(jié)果表明該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬，可用于LC注射液的含量測定和有關(guān)物質(zhì)——雜質(zhì)A的檢測。

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（收稿日期：2015-04-03 本文編輯：許俊琴）