任 峰 李 健 賀國洋 賈昭華 千新來

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

鐵是人體維持正常生理活動必不可少的微量元素，參與氧轉(zhuǎn)運、電子傳遞、DNA合成及許多酶促反應(yīng)等生理過程。越來越多的證據(jù)顯示，機體鐵過載通過影響DNA合成與復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、細(xì)胞鐵攝取與外排等促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔1,2〕。膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(FPN)是細(xì)胞唯一的鐵輸出蛋白。Hepcidin是維持機體鐵穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子〔3,4〕，能夠結(jié)合、降解細(xì)胞膜上FPN，減少機體鐵的吸收和巨噬細(xì)胞鐵的釋放，增加循環(huán)可利用鐵〔5,6〕。研究表明，機體鐵病理性積累可能與腫瘤的發(fā)生、演進密切相關(guān)，去鐵治療已經(jīng)成為一種新的腫瘤治療方案〔7〕。當(dāng)歸多糖(ASP)是傳統(tǒng)的補血、活血中藥。近年研究表明，ASP具有增強機體免疫力和抗腫瘤作用〔8～11〕。本研究探討ASP對Hepcidin的調(diào)節(jié)作用，以期為ASP抗腫瘤藥物開發(fā)和臨床治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 人正常肝細(xì)胞L-02和人肝癌細(xì)胞HepG2購自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2試劑 當(dāng)歸多糖(純度>98%，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，批號CY110320)，無支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)， RPMI1640培養(yǎng)基，(美國Invitrogen公司)，青鏈霉素(美國Hyclone公司)，RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs(日本TaKaRa公司)，anti-Hepcidin，anti-β-actin抗體(英國abcam公司)。

1.3細(xì)胞總RNA提取、定量和RT-PCR 細(xì)胞處理：細(xì)胞接種于6孔板后培養(yǎng)12 h，觀察生長狀態(tài)。ASP最佳誘導(dǎo)濃度的確定，實驗分4組，分別用0、100、200、400 mg/L的ASP誘導(dǎo)HepG2和L-02細(xì)胞48 h，以0 mg/L的ASP為對照組。APS最佳誘導(dǎo)時間的確定，實驗分5組，用400 mg/L的ASP誘導(dǎo)HepG2和L-02細(xì)胞0、24、48、72 h和96 h，以ASP誘導(dǎo)0 h為對照組。按Trizol試劑說明書，提取細(xì)胞總RNA并定量。按照RT-PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以合成的cDNA為模板采用RT-PCR方法檢測Hepcidin mRNA表達(dá)。Hepcidin引物序列：正義鏈5′-cctgaccagtggctctgttt-3′，反義鏈5′-cacatcccacactttgatcg-3′，擴增片段長度，183 bp；GAPDH引物序列；正義鏈5′-aatcccatcaccatcttcca-3′，反義鏈5′-cctgcttcaccaccttcttg-3′，擴增片段長度580 bp。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性2 min,94℃ 1 min,51℃ 45 s，72℃ 1 min， 35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。以GAPDH為內(nèi)參照。Bandleader 3.0圖像軟件分析結(jié)果。

1.4Hepcidin蛋白檢測 細(xì)胞處理：400 mg/L 的ASP誘導(dǎo)HepG2和L-02細(xì)胞96 h，以ASP未處理組為對照組。常規(guī)胰蛋白酶消化法收集對數(shù)生長期ASP處理后HepG2和L-02細(xì)胞總蛋白提取、定量及變性見參考文獻(xiàn)〔11〕，提取總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后4°C封閉過夜,Ⅰ抗，Ⅱ抗孵育，檢測Hepcidin蛋白表達(dá)。Hepcidin多克隆抗體(兔抗小鼠，稀釋1∶100)、β-actin多克隆抗體(兔抗小鼠，稀釋1∶1 000)和辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(稀釋1∶5 000)。用Quantity one version 4.1.1軟件對Western印跡條帶進行采集和分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單向方差分析。

2 結(jié) 果

2.1ASP調(diào)控HepG2和L-02細(xì)胞Hepcidin mRNA表達(dá) 不同濃度ASP(0，100，200，400 mg/L)處理HepG2和L-02細(xì)胞48 h，RT-PCR方法檢測Hepcidin mRNA。結(jié)果顯示，ASP(200 mg/L，400 mg/L)可顯著下調(diào)HepG2和L-02細(xì)胞Hepcidin mRNA，且具有一定的劑量依賴性(P<0.01)，見圖1，表1。后續(xù)實驗選用400 mg/L ASP進行研究。400 mg/L的ASP處理HepG2和L-02細(xì)胞，RT-PCR方法檢測不同時間點(24 h、48 h、72 h和96 h)Hepcidin的表達(dá)(圖2，表2)，結(jié)果顯示；Hepcidin mRNA均顯著下調(diào)，且呈現(xiàn)時間依賴性(P<0.01)。后續(xù)實驗中對HepG2和L-02細(xì)胞，ASP誘導(dǎo)濃度和時間采用：400 mg/L，96 h。

M：DNA marker,1～4：0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L圖1 不同濃度ASP處理細(xì)胞48 h后Hepcidin mRNA表達(dá)RT-PCR擴增結(jié)果

表1 Hepcidin mRNA 水平表達(dá)變化RT-PCR檢測結(jié)果

M：DNA marker,1～5：0 h、24 h、48 h、72 h和96 h圖2 400 mg/L的ASP處理細(xì)胞不同時間點Hepcidin mRNA表達(dá)RT-PCR擴增結(jié)果

表2 Hepcidin mRNA 水平表達(dá)變化RT-PCR檢測結(jié)果

2.2ASP對HepG2和L-02細(xì)胞Hepcidin表達(dá)的影響 用400 mg/L的ASP誘導(dǎo)HepG2和L-02細(xì)胞96 h，Western印跡方法檢測Hepcidin的表達(dá)(圖3，表3)，結(jié)果顯示：ASP可明顯下調(diào)HepG2和L-02細(xì)胞Hepcidin表達(dá)(P<0.01)。與對照組相比，抑制率分別為62%和74%。

1：HepG2細(xì)胞；2：ASP+HepG2細(xì)胞 3：L-02細(xì)胞； 4：ASP+L-02細(xì)胞圖3 ASP對HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞Hepcidin表達(dá)的影響

表3 Hepcidin蛋白水平表達(dá)變化檢測結(jié)果

3 討 論

當(dāng)歸為常用中藥材，具有補血、調(diào)經(jīng)、抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、提高機體免疫力、預(yù)防和治療糖尿病等作用。ASP為當(dāng)歸主要有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究證明ASP具有抗腫瘤作用〔8～10〕。鐵過載與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔12～15〕。研究表明，一是腫瘤細(xì)胞快速增殖需要大量的鐵，二是機體鐵過載導(dǎo)致細(xì)胞基因突變、氧化應(yīng)激損傷、癌基因激活等，增強腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力，促進腫瘤血管生成〔16〕。

Hepcidin是維持機體鐵穩(wěn)態(tài)的小分子多肽，其作用靶點FPN是哺乳動物細(xì)胞膜上唯一的鐵運出蛋白。Hepcidin能夠誘導(dǎo)FPN泛素使其降解，發(fā)揮調(diào)控腸道鐵的吸收和儲鐵細(xì)胞釋放鐵的作用，從而影響機體循環(huán)鐵水平〔9，10〕。研究發(fā)現(xiàn)，正常人和腫瘤患者機體血清均有FPN和Hepcidin表達(dá)，但腫瘤患者Hepcidin表達(dá)顯著增加且FPN表達(dá)顯著減少〔17,18〕，提示Hepcidin表達(dá)增加可降解FPN，導(dǎo)致機體鐵沉積，增加腫瘤細(xì)胞生物可利用鐵〔19〕。

本研究表明，200和400 mg/L的ASP顯著下調(diào)人肝癌細(xì)胞HepG2和人正常肝細(xì)胞L-02 Hepcidin基因水平，且呈劑量、時間相關(guān)；Western印跡證實ASP能夠在蛋白水平下調(diào)HepG2和L-02細(xì)胞Hepcidin表達(dá)。這與已報道的小分子質(zhì)量ASP顯著抑制大鼠正常肝細(xì)胞Hepcidin表達(dá)結(jié)果一致〔20〕。

機體鐵超載是腫瘤發(fā)生的危險因素，目前尚未見通過藥物治療下調(diào)Hepcidin表達(dá)，降低機體鐵負(fù)荷，抑制腫瘤惡性表型的研究報道。本文證實ASP能夠在細(xì)胞水平抑制機體鐵代謝關(guān)鍵調(diào)控因子Hepcidin的表達(dá)，但能否在體內(nèi)通過下調(diào)Hepcidin的表達(dá)，降低腫瘤患者機體鐵負(fù)荷還有待進一步研究。