趙啟含，常宇，馬玉芹，潘利華

（1.長春理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，長春 130022；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春 130022）

均相時間分辨熒光免疫分析（HTRF）是一種快速、簡便且抗干擾性強(qiáng)的分析技術(shù)，是將熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)和時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TRFIA）相結(jié)合而形成的一種新的方法[1-3]。TRFIA是以稀土離子螯合劑為標(biāo)記物進(jìn)行檢測分析，利用鑭系元素的熒光特性可以有效地排除非特異熒光的干擾。而HTRF是在其基礎(chǔ)上利用免疫反應(yīng)生成免疫復(fù)合物的標(biāo)記信號與未反應(yīng)的標(biāo)記物信號之間明顯的差異進(jìn)行分析檢測的，所以在溶液中不需分離處理便可直接進(jìn)行測定。HTRF具有操作簡單、高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性、水溶性等優(yōu)異特點[4-7]，在臨床醫(yī)學(xué)、化學(xué)分析等領(lǐng)域[8-11]受到大量關(guān)注。

HTRF中設(shè)計合成具有高穩(wěn)定性、高靈敏度、高特異性、良好水溶性的穴狀雙功能稀土螯合劑是極具挑戰(zhàn)性的工作。該類螯合劑的雙功能性表現(xiàn)在可同時與蛋白質(zhì)和稀土離子連接，連接后，不會影響蛋白質(zhì)活性且具備稀土離子的優(yōu)異性質(zhì)。

本實驗從HTRF的需求考慮，設(shè)計制備一種稀土銪雙功能螯合劑。以2，6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯為原料，合成2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2’-聯(lián)吡啶-6，6’-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸-Eu3+，通過IR、MS等表征方法確認(rèn)各合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。并對其光譜性質(zhì)進(jìn)行研究。螯合劑的結(jié)構(gòu)及合成路線如圖1所示。

圖1 所合成的配體及螯合劑的結(jié)構(gòu)及合成路線

1 實驗

1.1 主要儀器和試劑

FTSB5傅立葉紅外光譜儀（上海大中分析儀器廠）；DSC-7差熱分析儀（美國Pericin Elmer公司）；7.0 T型超導(dǎo)磁體型傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（美國IonSpec公司）；Unity-400MHz核磁共振儀（美國Varian公司）；Hitachi F-7000型熒光光譜儀（日本HAMAMATSU公司）；C10027型光子多通道分析儀（日本HAMAMATSU公司）；FLSP-920型研究級光譜儀（英國愛丁堡儀器公司）；熒光壽命測量儀（課題組自主研制）。

2，6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯（濟(jì)南某公司）；N-溴代丁二酰亞胺（肯特催化有限公司）；偶氮二異丁腈（江蘇全威化工）；中性氧化鋁（國藥試劑）。C18反相硅膠（濟(jì)南博納生物技術(shù)）三氯甲烷、三氟乙酸、甲醇、叔丁醇等所用試劑規(guī)格均為AR級純度。

1.2 中間體合成

1.2.1 2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯（化合物P1）的合成

無水無氧條件下，將2，6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯（1g，5.54mmol），1.91g N-溴代丁二酰亞胺（NBS），四氯化碳（100ml）置于反應(yīng)瓶中，攪拌10min，原料一部分溶解，加入0.04g偶氮二異丁腈（AIBN）。當(dāng)溫度為40℃時，50W鹵素?zé)暨M(jìn)行激發(fā)照射，將體系溫度升高至77℃，在回流狀態(tài)下反應(yīng)2h，冷卻至室溫，用40ml飽和NaHCO3溶液洗，除去反應(yīng)過程中產(chǎn)生的琥珀酰亞胺[12]，三氯甲烷萃取（20ml×4），有機(jī)相用無水Na2SO4干燥。隔天過濾，并在真空狀態(tài)下除去溶劑，得到棕黃色油狀液體。以柱層析方式純化分離（淋洗劑：二氯甲烷），得到純凈的化合物P1?？偸樟?15.4mg，總產(chǎn)率24.14%，封好放于干燥器內(nèi)備用。

1.2.2 2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2'-聯(lián)吡啶-6，6'-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸甲酯（化合物P2）的合成

無水無氧的條件下，將N，N'，N，N'-[二（2，2'-聯(lián)吡啶-6，6'-二甲基）]二胺（133mg，0.338mmol）溶于乙腈（267ml）中，攪拌10min（固體一部分溶解），向溶液中加入251mg的Li2CO3，提升溫度至反應(yīng)液回流（80℃～83℃），60min后。向體系中滴加原料2化合物P1的乙腈溶液{P1（110mg，0.341mmol）+乙腈（67ml）}，控制滴加速率，2h內(nèi)滴完。繼續(xù)反應(yīng)30h。冷卻反應(yīng)液至30℃，用250ml沙漏抽濾，真空狀態(tài)下蒸干溶劑。用柱層析方式純化分離（淋洗劑為V二氯甲烷：V甲醇=9：1），得到90.4mg的純凈的化合物P2，產(chǎn)率46.05%，封好放于干燥器內(nèi)備用。

1.3 螯合劑合成

1.3.1 2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2'-聯(lián)吡啶-6，6'-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸甲酯-Eu3+（化合物P3）的合成

氮氣保護(hù)的狀態(tài)下，將原料化合物P2（40mg，5.68×10-5mol）溶解于 10ml的無水甲醇中，固體全溶，攪拌狀態(tài)下，將預(yù)先制備的EuCl3.6H2O（23.6mg）加入到反應(yīng)瓶中，溶液呈無色透明狀，升高溫度至溶液沸騰回流（65℃～68℃），23h后反應(yīng)結(jié)束，冷水浴冷卻至室溫，加入5ml乙醚，出現(xiàn)白色的絮狀沉淀，抽濾、真空狀態(tài)下將沉淀物烘干，得到乳白色固體粉末32 mg，即化合物P3，不進(jìn)行純化處理，封好放于干燥器內(nèi)備用。

1.3.2 2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2'-聯(lián)吡啶-6，6'-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸-Eu3+（化合物P4）的合成

將原料化合物P3在堿性條件下水解，除去甲酯基團(tuán)，取化合物P3（20mg）溶于3mL無水CH3OH中，室溫下攪拌，溶液呈無色透明狀，將1mol/L的LiOH的水溶液0.1mL滴入反應(yīng)體系，溶液變白色渾濁，再加入0.5mL的1mol/L的LiOH水溶液，渾濁度增大，室溫下反應(yīng)3.5h，蒸干反應(yīng)溶劑，以C18反相硅膠為固定相進(jìn)行柱層析純化，對（乙腈：1%三氟乙酸水溶液=7：3，V：V），得到乳黃色粉末固體9mg，即Eu3+-螯合劑（化合物P4），產(chǎn)率為43.44%，粉末在紫外燈下照射可發(fā)出明亮的橘紅色光，封好放于干燥器內(nèi)備用。

1.3.3 化合物P4（螯合劑）溶液的配制

取0.81mg的化合物P4，用2ml的二次水溶解，固體全溶后，再用二次水定容到10ml的容量瓶中，配制成濃度為1×10-4mol/L的螯合劑水溶液。封好，用于檢測螯合劑的激發(fā)光譜、熒光光譜以及熒光壽命。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成方法優(yōu)化

2.1.1 化合物P1

利用NBS對原料溴化制備化合物P1，主要是NBS的溴自由基脫離并與原料進(jìn)行連接的過程，此類反應(yīng)過程中不僅需要光的照射激發(fā)還要用引發(fā)劑來促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行[8]，本文選用AIBN作為引發(fā)劑，并研究了不同光源照射以及NBS使用量等對化合物P1產(chǎn)率的影響。

（1）不同光源照射對化合物P1產(chǎn)率的影響

確定其他反應(yīng)條件不變，研究不同光源照射對反應(yīng)后化合物P1產(chǎn)率的影響。

用100W照明燈與50W鹵素?zé)舴謩e進(jìn)行試驗，兩種燈光激發(fā)照射下，反應(yīng)均可進(jìn)行，但是照明燈在達(dá)到與鹵素?zé)粝嗤a(chǎn)率時，所用時間較長（4h，鹵素?zé)魹?h），兩種燈光照射均用薄層色譜法（TLC）檢測，可以發(fā)現(xiàn)鹵素?zé)粽丈浞磻?yīng)進(jìn)程很快。雖產(chǎn)生副產(chǎn)物點稍多，但對化合物P1產(chǎn)率幾乎無影響，這可能是因為鹵素?zé)粽丈浯龠M(jìn)了溴自由基的生成，在較短的時間內(nèi)即可產(chǎn)生大量的溴自由基，加快了反應(yīng)進(jìn)程。因此，綜合考慮，本實驗選用50W鹵素?zé)暨M(jìn)行照射。

（2）NBS使用量對化合物P1產(chǎn)率的影響

在其他反應(yīng)條件為最佳的情況下，研究不同NBS使用量對反應(yīng)后化合物P1產(chǎn)率的影響，研究結(jié)果如表1所示。

表1 NBS使用量對化合物1產(chǎn)率的影響

當(dāng)NBS：2，6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯為1：1.9時化合物P1的產(chǎn)率最高。NBS含量過少的原因是，反應(yīng)進(jìn)行不完全，但是NBS過多時，反應(yīng)液中溴自由基含量過多，生成過多的副產(chǎn)物（-CBr3/-CHBr2），使目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率降低。

2.1.2 反應(yīng)時間對化合物P2的影響

在其他反應(yīng)條件為最佳的情況下，對化合物P2的反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表2所示。

表2 反應(yīng)時間對化合物P2產(chǎn)率的影響

當(dāng)反應(yīng)時間為22h、26h時，反應(yīng)不完全，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率較低，當(dāng)反應(yīng)時間為30h時，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率最高為46.05%。

2.2 合成產(chǎn)物的表征

2.2.1 2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯（化合物P1）的表征

圖2所示為2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯（化合物 P1）的質(zhì)譜，MS（70eV）m/z（%）：（M+H）+=324.0與化合物P1加氫的分子量理論值相符。

圖3所示2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯（P1）的核磁氫譜，δ：3.98有單峰，為酯中甲基的3個氫；δ：4.59有單峰為溴取代甲基中的4個氫，δ：7.92處的單峰為吡啶環(huán)中的2個氫，1H-NMR譜給出的各氫總數(shù)、出峰位置和化合物P1結(jié)構(gòu)吻合。

圖3 2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯的核磁（1H-NMR）譜圖

圖4所示為2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯（P1）的紅外光譜（a）與原料2，6-二甲基吡啶-4-羧酸甲酯的紅外光譜（b）對比可知，在616～582cm-1出現(xiàn)C-Br鍵的特征吸收峰，說明原結(jié)構(gòu)中的-CH3被溴化成功，其他特征峰位置基本不變。

圖4 化合物P1（a）及其原料（b）的紅外光譜（IR）

2.2.2 2，6-｛N，N ′，N，N ′-[二（2，2 ′-聯(lián)吡啶-6，6′-二甲基）]二氨甲基｝-吡啶-4-羧酸甲酯（化合物P2）的表征

圖5所示為化合物P2的核磁氫譜1H-NMR（以CDCl3作為測試溶劑，射頻電磁波的頻率為400MHz），δ：3.95～4.10分別為酯中甲基的3個氫以及6個亞甲基中的12個氫共15個氫；δ：7.41～7.90為吡啶環(huán)中的14個氫，1H-NMR譜給出的氫個數(shù)、特征峰位置和其分子結(jié)構(gòu)相符?；衔颬2的分子量理論值是555，圖6所示為化合物P2的質(zhì)譜圖，MS（70eV）m/z（%）：（M+Na）+=578.2與化合物P2加鈉的分子量理論值相符。

圖5 化合物P2的1H NMR譜

2.2.3 2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2’-聯(lián)吡啶-6，6’-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸甲酯-Eu3+（化合物P3）的表征

化合物P3的分子量理論值為708，圖7所示為化合物P3的質(zhì)譜，MS（70eV）m/z（%）：（L+Eu3++2Cl-）+=778.0與化合物P3加上稀土離子Eu3+以及中和其正電荷的兩個氯離子Cl-的分子量理論值相符。

圖7 化合物P3的質(zhì)譜（MS）

2.2.4 螯合劑2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2'-聯(lián)吡啶-6，6'-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸-Eu3+（化合物P4）的表征

螯合劑P4的分子量理論值是694.1，圖8所示為Eu3+-螯合劑（化合物P4）的質(zhì)譜，MS（70eV）m/z（%）：（L+Eu3+-H++CF3COO-）+=806.1與其加上CF3COO-的分子量理論值相符。

圖8 Eu3+-螯合劑（化合物P4）的質(zhì)譜（MS）

2.3 Eu3+-螯合劑（化合物P4）的熒光光譜分析

取1×10-4mol/L的Eu3+-螯合劑（化合物P4）溶液液，稀釋其濃度至10-5mol/L，室溫下測試其熒光性質(zhì)，測試數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 化合物P4的熒光性質(zhì)

圖9所示為Eu3+-螯合劑（化合物P4）在600V電壓下的激發(fā)光譜和熒光光譜，該螯合劑的激發(fā)范圍是230～330nm，最大激發(fā)波長為320nm，發(fā)射波長為 584nm（5D0-7F1）、597nm（5D0-7F2）、618nm（5D0-7F3），最大發(fā)射波長為597nm（5D0-7F2[13]），激發(fā)和發(fā)射光譜間沒有重疊，stokes位移可達(dá)到277 nm，此Eu3+-螯合劑的熒光發(fā)射強(qiáng)度較高，發(fā)射峰尖銳。符合HTRF技術(shù)的分析要求。

圖9 Eu3+-螯合劑的激發(fā)和熒光光譜

圖10所示為Eu3+-螯合劑（化合物P4）的熒光衰減曲線，通過單指數(shù)擬合可知此Eu3+-螯合劑的熒光壽命為0.828ms，可以有效地避免本底熒光的干擾，符合HTRF的分析要求。

圖10 Eu3+-螯合劑的熒光衰減曲線

量子產(chǎn)率Φ是所有處于激發(fā)態(tài)的稀土螯合劑經(jīng)過輻射躍遷返回基態(tài)的分子個數(shù)與其總分子數(shù)的比值，一般用量子產(chǎn)率表達(dá)熒光螯合物的熒光發(fā)射強(qiáng)度，其值越大，強(qiáng)度越強(qiáng)，分析技術(shù)中一般要求熒光標(biāo)記物的量子產(chǎn)率在0.1～1之間。該Eu3+-螯合劑的熒光量子產(chǎn)率為0.235（322nm氙燈激發(fā)），可以達(dá)到分析技術(shù)中的應(yīng)用要求，Eu3+-螯合劑具有一定實際應(yīng)用價值。

圖11所示為Eu3+-螯合劑（化合物P4）濃度梯度曲線，最初配制的濃度為1.12×10-4mol/L的溶液，經(jīng)稀釋分別配成濃度為2.23×10-6mol/L、1.24×10-6mol/L、5.93×10-7mol/L、1.79×10-8mol/L進(jìn)行濃度梯度檢測，該螯合劑在水中的摩爾濃度與其相對熒光強(qiáng)度呈線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.995，而且即使在摩爾濃度很低時，仍具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。

圖11 Eu3+-螯合劑的濃度梯度曲線

3 結(jié)論

本論文以2，6-二溴甲基吡啶-4-羧酸甲酯為原料經(jīng)NBS溴化、酯水解等反應(yīng)過程合成螯合劑2，6-{N，N'，N，N'-[二（2，2’-聯(lián)吡啶-6，6’-二甲基）]二氨甲基}-吡啶-4-羧酸-Eu3+，并通過1H NMR、IR、MS、DSC等表征方法對各配體及螯合劑的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)，并對螯合劑的光譜性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：該螯合劑的激發(fā)光譜譜帶較寬、最大激發(fā)波長為320nm，最大發(fā)射波長為597nm（5D0-7F2），激發(fā)光譜與熒光光譜間不重疊，熒光壽命高達(dá)828μs，熒光量子產(chǎn)率Φ為0.235。螯合劑在水中的摩爾濃度與其相對熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.995，且在較低濃度下，該配體仍然具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，而且螯合劑具有較長的熒光壽命能夠有效的避免背景熒光的干擾，達(dá)到了時間分辨熒光的效果。綜上所述，該Eu3+-螯合劑可以滿足HTRF的分析要求。