孫婷婷，孫基豐，周紫薇，褚春旭，張昊

（長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

AKR作為NADPH依賴(lài)的氧化還原酶[1]家庭成員當(dāng)中的一種，AKR家族的存在十分廣泛，在原核和真核生物當(dāng)中都存在該種類(lèi)型的酶[2]。文獻(xiàn)表明人源AKR家族種類(lèi)已發(fā)現(xiàn)了15個(gè)[3]AKR酶家族主要參與生物機(jī)體內(nèi)醛酮類(lèi)化合物的代謝過(guò)程，并在醛類(lèi)和相關(guān)化合物的解毒時(shí)期發(fā)揮著不可忽視的作用。AKR家族酶的底物主要有脂肪族和芳香族的醛/酮類(lèi)的化合物[4]。所以該酶在生成激素、藥物的分解排出、炎癥反應(yīng)、解毒等生物活動(dòng)中有著不可忽視的作用[5]。AKR大多以37kDa的單體類(lèi)型出現(xiàn)在細(xì)胞漿中[6-8]。不同種類(lèi)間的分布以及作用是不一樣的，比如說(shuō)AKR6家族能夠控制K+通道的開(kāi)放，AKR1、AKR6、AKR7三個(gè)種類(lèi)在哺乳動(dòng)物機(jī)體中均有表達(dá)，其功能是參加生物的生命代謝過(guò)程[9]。有關(guān)報(bào)道顯示，AKR7亞類(lèi)型中的成員AKR7A2和AKR7A3主要參加肝臟對(duì)黃曲霉毒素的解毒的過(guò)程，其中AKR7A3主要是參與肝臟中AFB1類(lèi)的毒性解除作用[10]。但是關(guān)于A(yíng)KR7A3酶學(xué)活性的相關(guān)研究很少。

大腸桿菌是科研實(shí)驗(yàn)中最常用的高效表達(dá)異源蛋白的原核表達(dá)工具，其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單[11]。但并不是所有外源遺傳物質(zhì)都能夠在這種表達(dá)體系中進(jìn)行有效表達(dá)[12]，主要由于不同的遺傳物質(zhì)有不同構(gòu)造、mRNA的穩(wěn)定性[13]、翻譯、折疊、宿主細(xì)胞蛋白酶的降解作用，大腸桿菌密碼子在原核和真核基因使用上的區(qū)別，以及蛋白質(zhì)對(duì)宿主的產(chǎn)生相對(duì)的毒性[14]等因素。因此，本文對(duì)于人源AKR7A3基因序列進(jìn)行相應(yīng)的密碼子優(yōu)化，構(gòu)建原核表達(dá)體系，優(yōu)化表達(dá)條件，獲得最大產(chǎn)量的可溶性酶蛋白，再通過(guò)酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，獲得最優(yōu)酶活性條件。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為后續(xù)AKR7A3研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 AKR7A3基因合成

從GENE BANK里面獲取AKR7A3全序列，選取相應(yīng)酶切位點(diǎn)，由上海生工合成并優(yōu)化得到AKR7A3-pET15b質(zhì)粒。

1.2 菌株和試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)菌株BL21（DE3），由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）配成100mg/mL濃度備用。低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白Marker和SDS-PAGE試劑購(gòu)自寶生物工程大連公司（進(jìn)口分裝）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 AKR7A3原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒AKR7A3-pET15b和pET 15b空載體分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，于37℃培養(yǎng)至OD600約為0.6，加入IPTG誘導(dǎo)5h。菌體離心后棄上清，得到的菌體沉淀用100μL PBS重懸后進(jìn)行分離純化。蛋白樣品分別加入100μL 2×SDS PAGE上樣緩沖液，沸水中處理5min，12000rpm/min瞬時(shí)離心后取20μL上清進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。以pET 15b空載體和未加IPTG的AKR7A3-pET15b菌為對(duì)照鑒定目的基因AKR7A3的表達(dá)情況。

1.4 溫度對(duì)重組菌AKR7A3表達(dá)的影響

BL21-pET15b-AKR7A3在轉(zhuǎn)速180rpm、5h、誘導(dǎo)劑終濃度為1mM/L條件不變，溫度分別為37℃、30℃、24℃、16℃的環(huán)境下進(jìn)行表達(dá)。將其菌體進(jìn)行收集、超聲破碎，將得到的上清進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 轉(zhuǎn)速對(duì)重組菌AKR7A3表達(dá)的影響

BL21-pET15b-AKR7A3在溫度 37℃，5h，誘導(dǎo)劑終濃度為1mM/L條件不變，轉(zhuǎn)速分別為110rpm、130rpm、150rpm、180rpm的條件下進(jìn)行表達(dá)。將其菌體進(jìn)行收集、超聲破碎，離心使用上清進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 時(shí)間對(duì)重組菌AKR7A3表達(dá)的影響

BL21-pET15b-AKR7A3在37℃、180rpm，誘導(dǎo)劑終濃度為1mM/L條件不變，表達(dá)時(shí)間分別為5h、10h、16h、20h的條件下進(jìn)行表達(dá)。將其菌體進(jìn)行收集、超聲破碎，離心使用上清進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)重組菌AKR7A3表達(dá)的影響

BL21-pET15b-AKR7A3在37℃、180rpm，5h條件不變，誘導(dǎo)劑終濃度分別為0.40mM/L、0.60mM/L、0.80mM/L、1.00mM/L環(huán)境下進(jìn)行表達(dá)。將其菌體進(jìn)行收集、超聲破碎，離心使用上清進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 醛酮還原酶AKR7A3酶活性動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

1.8.1 最佳反應(yīng)溫度確定

酶反應(yīng)體系300μL；DL-甘油醛作為底物；NADPH作為體系輔酶；2%的乙腈為共溶劑；100mM/L PBS為反應(yīng)的緩沖溶液；PH需要控制在7.0；設(shè)置反應(yīng)溫度為20℃、25℃、30℃、37℃以及40℃，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5分鐘，反應(yīng)后在340nm處測(cè)定吸光數(shù)值。

1.8.2 最佳反應(yīng)PH值確定

酶反應(yīng)體系300μL；DL-甘油醛為底物；NADPH作為體系輔酶；2%的乙腈為共溶劑；100mM/L PBS為反應(yīng)的緩沖溶液；反應(yīng)溫度設(shè)置為37℃；將其PH值設(shè)置為5.00、6.00、7.00、8.00以及9.00，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5分鐘，反應(yīng)后在340nm.處測(cè)定吸光數(shù)值。

1.8.3 最佳反應(yīng)NADPH輔酶濃度確定

酶反應(yīng)體系300μL；DL-甘油醛為底物；NADPH作為體系輔酶；2%的乙腈為共溶劑；100mM/L PBS為反應(yīng)的緩沖溶液；反應(yīng)溫度為37℃；PH設(shè)置為7.00，NADPH輔酶濃度設(shè)置為0.10mmol/L、0.15mmol/L、0.20mmol/L、0.30mmol/L、0.40mmol/L，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5分鐘，反應(yīng)后在340nm處測(cè)定吸光數(shù)值。

1.8.4 最佳反應(yīng)底物濃度確定

酶反應(yīng)體系300.00μL；DL-甘油醛為底物；NADPH作為體系輔酶；2%的乙腈為共溶劑；使用100mM/L PBS作為反應(yīng)的緩沖溶液；反應(yīng)溫度為37℃；PH控制在7.0；底物濃度分別為2.00mmol/L、4.00mmol/L、 6.00mmol/L、 8.00mmol/L、10.00mmol/L，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5分鐘，反應(yīng)后在340nm處測(cè)定吸光數(shù)值。

1.8.5 最佳加酶量確定

酶反應(yīng)體系300μL；DL-甘油醛為底物；NADPH作為體系輔酶；2%的乙腈為共溶劑；100mM/L PBS作為反應(yīng)的緩沖溶液；反應(yīng)溫度為37℃；PH控制在7.00；酶的用量分別為16ng、40ng、64ng、80ng、96ng幾個(gè)梯度，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5分鐘，反應(yīng)后在340nm處測(cè)定吸光數(shù)值。

1.8.6 最佳反應(yīng)底物確定

酶活反應(yīng)體系300uL；DL-甘油醛作為底物；NADPH作為體系輔酶；2%的乙腈作為共溶劑；100mM/L PBS作為反應(yīng)的緩沖溶液；反應(yīng)溫度為37℃；PH控制在7.0；底物分別為睪丸酮、孕酮、DL-甘油醛、雌二醇、甲睪酮、雌酮，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5分鐘，反應(yīng)后在340nm處測(cè)定吸光數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 BL21-pET15b-AKR7A3表達(dá)菌構(gòu)建結(jié)果

圖1 BL21-pET15b-AKR7A3質(zhì)粒鑒定

圖1中可以看出，M為15000marker，1泳道為空的pET-15b載體，其余條帶均比1泳道高。證明在氨芐青霉素平板上挑選的單菌落均成功轉(zhuǎn)入pET15b-AKR7A3質(zhì)粒，并說(shuō)明AKR7A3的表達(dá)載體已成功構(gòu)建，能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 AKR7A3蛋白表達(dá)結(jié)果

圖2中可以看出，M為15000marker，1泳道為BL21-pET15b-AKR7A3表達(dá)菌的上清液，其中目的蛋白醛酮還原酶AKR7A3大量表達(dá)，其大小約為36kDa。4泳道為NPI-1流出液，其中無(wú)目的蛋白條帶，說(shuō)明醛酮還原酶AKR7A3與鎳柱充分結(jié)合。2，3泳道為洗脫后流出液，其中3泳道無(wú)雜蛋白，蛋白純度能夠達(dá)到99%。

圖2 AKR7A3蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖

2.3 表達(dá)溫度優(yōu)化結(jié)果

在圖3中可以看出，醛酮還原酶AKR7A3在溫度為37℃、30℃、24℃、16℃環(huán)境下的表達(dá)情況。其中4泳道溫度為16℃，其上清中醛酮還原酶AKR7A3表達(dá)量是最多的。

圖3 溫度優(yōu)化結(jié)果

2.4 表達(dá)轉(zhuǎn)速優(yōu)化結(jié)果

圖4中可以看出，醛酮還原酶AKR7A3在轉(zhuǎn)速分別為110rpm、130rpm、150rpm、180rpm條件下的表達(dá)情況。1泳道是轉(zhuǎn)速為110rpm，上清中的醛酮還原酶AKR7A3表達(dá)量最多。

圖4 轉(zhuǎn)速優(yōu)化結(jié)果

2.5 表達(dá)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

在圖5可以看到，醛酮還原酶AKR7A3表達(dá)時(shí)間分別為5h、10h、16h、20h條件下的表達(dá)情況。其中4泳道為20h，上清中的醛酮還原酶AKR7A3表達(dá)量是最多的。

圖5 表達(dá)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

2.6 誘導(dǎo)劑IPTG濃度優(yōu)化結(jié)果

在圖6中可以看到，醛酮還原酶AKR7A3在誘導(dǎo)劑終濃度分別為0.40mM/L、0.60mM/L、0.80mM/L、1.00mM/L條件下的表達(dá)情況。4泳道誘導(dǎo)劑濃度為1.0mM/L，上清中的醛酮還原酶AKR7A3表達(dá)量是最多的。

圖6 表達(dá)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

2.7 醛酮還原酶AKR7A3酶活性檢測(cè)

從溫度、PH、底物、NADPH、酶量等因素優(yōu)化來(lái)看，測(cè)得最佳動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：

在不同溫度（20℃、25℃、30℃、37℃、40℃）下檢測(cè)AKR7A3酶活力，結(jié)果表明在37℃時(shí)酶活力最高，如圖7（a）。在不同PH值（5.00、6.00、7.00、8.00、9.00）下檢測(cè)AKR7A3酶活力，結(jié)果表明在PH=7酶活力最高，如圖7（b）。不同NADPH濃度（0.10、0.15、0.20、0.30、0.40mmol/L）下檢測(cè)AKR7A3酶活力，結(jié)果表明在0.2mmol/L時(shí)酶活力最高，如圖7（c）。在底物不同濃度（2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mmol/L）下檢測(cè)AKR7A3酶活力，結(jié)果表明在2.00mmol/L時(shí)酶活力最高，如圖7（d）。在不同加酶量（16.00ng、40.00ng、64.00ng、80.00ng、96.00ng）下檢測(cè)AKR7A3酶活力，結(jié)果表明在100μL時(shí)酶活力最高，如圖7（e）。在不同種類(lèi)反應(yīng)底物下檢測(cè)酶活力，結(jié)果表明睪丸酮＞雌酮＞孕酮＞甲睪酮＞DL-甘油醛，但是在雌二醇為底物時(shí)醛酮還原酶檢測(cè)AKR7A3酶活力顯著小于其他底物，原因是由于雌二醇中沒(méi)有醛基/酮基，無(wú)法在醛酮還原酶的作用下進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)。如圖7（f）。

圖7 最佳酶活性確定

綜上所述，在 37℃；PH=7；NADPH 濃度0.2mmol/L；底物濃度2.00mmol/L；加酶量100μL；睪丸酮為底物時(shí)酶活力最高。

3 結(jié)論

本文為了能夠使得人源醛酮還原酶AKR7A3在該大腸桿菌BL21中正常表達(dá)，在GEN BANK中查找人源AKR7A3基因序列，依照大腸桿菌表達(dá)的相關(guān)特征，對(duì)人源基因序列進(jìn)行密碼子的相應(yīng)優(yōu)化。合成優(yōu)化后的醛酮還原酶AKR7A3基因序列，構(gòu)建了AKR7A3-pET15b載體。使用大腸桿菌BL21作為宿主菌進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)AKR7A3表達(dá)的溫度、轉(zhuǎn)速、表達(dá)所需時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度等表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)的表達(dá)條件為16℃、110rpm/h、20小時(shí)以及誘導(dǎo)劑濃度達(dá)到1.00mM/L。在優(yōu)化后BL21-pET15b-AKR7A3能夠大量表達(dá)可溶性好、活性高、純度達(dá)99.0%的醛酮還原酶AKR7A3。酶活性動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，在37℃；PH=7；NADPH 濃度 0.2mmol/L；底物濃度2.00mmol/L；加酶量100μL；睪丸酮為底物時(shí)酶活力最高。

后續(xù)將在此基礎(chǔ)上，將通過(guò)基因重組大量制備AKR7A3酶蛋白，進(jìn)行酶激活劑及抑制劑的相關(guān)研究，從而篩選出對(duì)醛酮還原酶AKR7A3高效酶激活劑及抑制劑，為將來(lái)研究醛酮還原酶AKR7A3與相關(guān)癌癥發(fā)生與發(fā)展的基礎(chǔ)研究、以及及診斷與治療藥物研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。